转录因子DREB1A基因的克隆与植物表达载体的构建

根据GenBank中已发表的转录因子DREB1A基因的cDNA序列设计并合成了一对引物,通过RT-PCR的方法从低温处理的拟南芥总RNA中扩增出DREB1A基因的全长cDNA片段。将其克隆到pMD18 T-vector中。经测序证明该片段与GenBank上报道的序列具有99.8%的同源性。2个碱基的置换导致了一处氨基酸的差异,但这一氨基酸并不在基因的功能结构域上,推测其不会影响基因功能。以植物表达载体pBch为基础,构建了由组成型启动子35S调控的DREB1A基因的植物表达载体pBDR35S,为利用DREB1A基因改良植物抗逆性奠定了物质基础。     

Prd29A及DREB1A的克隆和干旱诱导型植物表达载体的构建与鉴定

从拟南芥中克隆了RD29A基因的启动子(Prd29A)及DREB1M基因的DNA片段,构建Prd29A:DREB1A融合基因,采用合成的接头将该融合基因插入到植物表达载体pBI121中,经鉴定,确认正确.     

转录因子DREB1A基因的克隆与Gateway克隆技术构建植物表达载体

目的:研究转录因子DREB1A在植物抗渗透胁迫反应中的作用,并探讨利用Gateway克隆技术构建植物表达载体的方法。方法:根据GenBank中登录的DREB1A基因的全长mRNA序列设计引物,克隆了拟南芥的转录因子DREBIA基因。根据Gateway克隆技术的要求,设计含有attB接头的引物,利用高保真的PlatinumpfxDNA聚合酶,通过PCR方法在克隆基因的两端加上B序列。通过BP反应将包含有attB接头的PCR产物克隆到含有attP的donor载体上以产生Entry克隆,通过LR反应将已经重组入Entry载体的DREB1A基因再克隆到pH2GW7双元载体。结果:对重组载体pH2GW7-DREB1A的鉴定结果表明成功构建了DREB1A基因的植物表达载体。结论:利用Gateway克隆技术构建植物表达载体简便易行,该结果为遗传转化研究奠定了基础。     

拟南芥、荠菜DREB1A基因的克隆与植物表达载体的构建

用PCR方法从拟南芥和荠菜中分别克隆了DREB1A基因.序列分析发现从拟南芥中克隆的AtDREB1A基因与已发表的AtDREB1A基因序列(DQ372533)的同源性为99.69%.首次从荠茱中克隆的CbDREB1A基因序列(EF156749)与DQ372533的同源性为99.54%.利用这两个基因分别构建了两个诱导表达载体(prd29A/AtDREB1A,prd29A/CbDREB1A)和两个组成型表达载体(pCaMV35S/AtDILEBlA,pCaMV35S/CbDREB1A),以便进一步开展植物抗旱基因工程研究.     

拟南芥AtVQ29基因的克隆与植物表达载体构建

目的:VQ模序蛋白是植物中所特有的一类具有高度保守序列的蛋白质,广泛参与植物的生长发育与逆境反应,本研究拟克隆拟南芥的AtVQ29基因并进一步构建由组成型启动子CaMV 35S驱动的植物表达载体pSN1301-AtVQ29。方法:采用CTAB法提取拟南芥基因组DNA,根据已报道的AtVQ29基因序列设计并合成引物,通过PCR技术扩增获得拟南芥AtVQ29基因,经T载体克隆后测序。利用生物信息学软件对序列进行初步分析,同时基于基因重组技术构建植物表达载体。结果:序列分析表明已成功克隆AtVQ29基因,该基因编码区全长为372bp,共编码123个氨基酸残基,具有保守的VQ模序。并进一步构建了由组成型启动子CaMV 35S驱动的AtVQ29基因植物表达载体pSN1301-AtVQ29。结论:本研究所构建的AtVQ29基因植物表达载体能够在转基因植株中过量表达AtVQ29基因,为后期开展基因功能研究与植物基因改良奠定了基础。     

拟南芥PR-1基因启动子的克隆与植物表达载体的构建

根据已报道的拟南芥（Arabidopsis thaliana L.）病程相关蛋白基因（PR-1）序列设计引物,通过PCR技术从拟南芥中扩增得到水杨酸诱导表达的PR-1基因启动子片段,序列分析表明,该启动子含910bp核苷酸,与已报道的序列比较,核苷酸的同源性为99．7％：将该启动子构建到植物表达载体pB1121上,获得病程相关蛋白基因（PR-1）启动子驱动的GUS报告基因的植物表达载体pBI-prlp,将其转入根癌农杆菌GV3101,通过农杆菌介导转化拟南芥,获得转基因拟南芥植株,为深入研究寄主-病原物相互作用的分子机理奠定基础。     

生长素结合蛋白cDNA的克隆及其在烟草中的表达

基于拟南芥内质网生长素结合蛋白基因的cDNA序列,设计合成了Ap5和Ap3两个引物,应用RT－PCR技术扩增了拟南芥的ABP基因。将该基因克隆在植物表达载体p35SSIN的35S启动子和Nos3’端之间,得到植物表达载体p35SE。通过农杆菌个导的方法对烟草SR1进行了转化,由分子杂交等检测证明,生长素结合蛋白基因已在烟草中表达,同时转基因烟草后代对生长素的敏感性明显增加。     

结缕草胁迫诱导型启动子Rd29A的克隆及功能鉴定

以结缕草基因组DNA为模板,根据已报道Rd29A启动子序列设计了一对特异引物,在优化的PCR反应条件下扩增出了Rd29A启动子的基因片段,通过序列分析与文献报道的基因序列有41.65％的同源性.在GenBank上的登录号为EU346948.利用GFP基因作为报告基因,构建了用于比较鉴定所克隆启动子活性的pBIG (35S-GFP)和pBIRG (Rd29A-GFP)两个植物表达载体,进而采用基因枪法对洋葱表皮细胞进行遗传转化,检测Rd29A启动子在受体细胞中调控基因表达的活性.结果表明,克隆到的Rd29A启动子活性强于组成型的35S启动子,利用GFP瞬时表达的分析方法有效的筛选到用于进行草坪草抗逆育种的启动子.     

高效删除标记基因的Bhlea2植物表达载体的构建

为培育去除选择标记基因的耐旱转基因植物,同时利用Cre/Lox和FLP/frt系统,构建一个能够高效删除标记基因的Bhlea2基因植物表达载体.拟南芥rd29A启动子是在低温、干旱、高盐胁迫下的快速应答启动子,玉米ubiquitin启动子可有效驱动外源基因的转录,拟南芥pAB5启动子是花粉及胚胎等发育早期特异表达的启动子,利用上述启动子构建了表达Bhlea2基因并能够删除标记基因的植物表达载体.该表达载体包括重组酶表达元件pAB5-FLP、Bhlea2抗旱基因表达元件rd29A-Bhlea2和bar标记基因表达元件ubiquitin-bar.     

荠菜CRABS CLAW的克隆与拟南芥遗传转化

根据GenBank收录的CRC基因cDNA序列设计引物,以短角果荠菜(Capsella bursa-pastoris)为材料,通过RT-PCR扩增出与拟南芥CRC基因同源的全长cDNA,进行测序、比对及同源性分析.结果显示,克隆的该基因cDNA序列与报道的拟南芥CRC序列一致性达到93%,可以推断其为荠菜CRC基因的cDNA(cbCRC).以Ti质粒pWM101为载体,构建了由CaMV35S启动子调控的cbCRC基因植物表达载体pWM101-cbCRC, 采用根癌农杆菌滴注柱头法转化拟南芥,获得了转cbCRC基因的拟南芥植株.转基因拟南芥心皮果荚形态大小发生了一定的变化,说明荠菜cbCRC基因在拟南芥中的表达对拟南芥心皮形态和大小都产生了一定影响,但其并没有使拟南芥表现出荠菜短角果的形态.     

大鼠D-双功能蛋白基因原核表达载体的构建及表达

利用原核表达系统构建大鼠D-双功能蛋白表达载体。设计基因拼接引物,通过RT-PCR合成DBP基因cDNA序列,将酶切、纯化的DBP基因与经相同处理的表达载体pET-28 a相连接,转化感受态大肠杆菌DH5α,筛选阳性重组子。将通过酶切及序列分析鉴定阳性的重组子质粒转入感受态大肠杆菌BL21-gold表达菌中,经IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE分析目的蛋白表达情况。结果显示,成功获得了包含DBP基因的双链cDNA序列,酶切、序列分析及Western blotting证实成功构建了DBP基因的原核表达载体。通过原核表达系统,DBP蛋白以包涵体形式产生,复性后可获得高表达的目的蛋白。     

人成骨蛋白成熟肽基因在毕赤酵母中的克隆及其序列分析

采用PCR方法,根据献报道的人成骨蛋白-1（OP-1）成熟肽基因序列,设计并合一对引物,从含人成骨蛋白基因的质粒中扩增获得大小的420bp的DNA片段,连接到pGEM-T载体进行测序,证明获得人成骨蛋白成熟肽基因片段,继之以pPIC3.5k为表达载体构建重组表达质粒,并经PCR及酶切鉴定。     

小麦尿卟啉原Ⅲ合成酶基因克隆及序列分析

根据水稻已公布的尿卟啉原Ⅲ合成酶(UROS)基因和小麦EST的保守序列,设计特异性引物对小麦尿卟啉原Ⅲ合成酶基因的部分片段进行克隆,得到了364 bp的cDNA(命名为UROS1)。以UROS1作为种子进行电子克隆,得到一段长为1210 bp的cDNA序列,并设计特异性引物克隆到1个1077 bp cDNA序列。对该片段分析结果表明,克隆得到的小麦UROS基因包含了信号肽区和全长的成熟肽区。小麦UROS基因与水稻UROS基因的同源性为86%左右,其推导氨基酸序列与水稻和拟南芥蛋白序列同源性分别约91%和79%。动物、植物以及微生物间核酸序列的保守性较低,氨基酸序列保守性也不高,但都存在UROS保守结构域(Hem D)。进化分析显示,该酶在不同物种间的进化速度差异较大。     

小麦中雄性不育同源序列的分离、鉴定及表达分析

利用拟南芥中已克隆的雄性核不育基因MS2和水稻中假定雄性不育蛋白的保守区域,设计一对简并引物,并在太谷核不育小麦可育株及不育株花药中进行扩增,得到了一条134bp的片段。以该片段为基础,通过电子延伸得到一个长为1604bp的序列,该序列编码的氨基酸包含一段由200个氨基酸组成的雄性不育保守区。RT-PCR结果表明,该雄性不育同源序列只在小麦可育花药中表达,而在小麦败育花药、叶片和根中不表达,说明该雄性不育同源序列为花药发育特异基因。     

六倍体大小麦tritordeum花药组织特异性启动子的鉴定与分离

启动子是基因表达调控的重要顺式元件,也是基因工程表达载体的一个重要元件。一个无启动子的带有UidA基因的质粒pPLGUS通过基因枪转化进tritordeum材料中,对转基因材料的多种不同组织进行了X-gluc显色来检测不同组织中的GUS活性,有一个株系的花药组织特异性启动子已被证明成功捕获,并通过PCR方法将其分离。提取叶片的总DNA作模板,上游使用水稻花药启动子分离的引物P1,以UidA基因的部分序列为下游引物P2,PCR扩增UidA基因的上游旁侧序列。已经获得一条长667 bp的目的片断,含有部分UidA基因的序列和一段UidA基因的上游旁侧序列,该序列中具有植物启动子的一些必备元件,初步断定它是一段花药组织特异性启动子序列。