添加次黄嘌呤或腺嘌呤提高肌苷产量

肌苷生产菌No.226具有将次黄嘌呤转变为肌苷的能力,添加次黄嘌呤有利于肌苷的积累。腺嘌呤缺陷型的肌苷生产菌株,在培养液中腺嘌呤的浓度对肌苷积累有显著影响。我们采用中国科学院上海生物化学研究所等单位选育的枯草芽孢杆菌7171-9-1菌株,进行舔加次黄嘌呤或腺嘌呤与酵母粉试验,现报道如下。     

肌苷产生菌guaA基因的修饰

由于肌苷生产菌枯草杆菌JSIM-1019,腺嘌呤缺陷,但黄嘌呤并不缺陷。以鸟苷产生菌枯草杆菌JSIM-G-518为供体菌,得到编码IMP脱氢酶的guaA基因。并用氯氨苄抗性基因插入guaA基因,使之不产生活性IMP脱氢酶,从而可制备黄嘌呤缺陷的新菌株,从而可以制备肌苷产量高于JSIM-1019的新菌株。     

肌苷产生菌枯草芽孢杆菌Bs菌株的选育和发酵条件

1．用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)腺嘌呤营养缺陷型(ade-)No 18经1次亚硝基胍(MNNG)。诱变处理及2次单菌落分离,获得了能利用酶法制造葡萄糖3次结晶母液,发酵生产肌苷的变异菌株B,。在适宜条件下,摇瓶肌苷产量在7.0克／升以上。 2．不同来源的酵母粉及其在培养基中的含量,对肌苷产量均有显著影响。在所试验的酵母粉中,以北京光华木材厂生产的圆酵母最好,在种子和发酵培养基中的逢合用量分别为1.0一1.4％和1.2一1.4％。 3．在发酵过程中,次黄嘌呤的积聚和肌苷积聚有着明显的消长关系。4．枯草芽孢杆菌B4菌株具有很强的分段合成肌苷的能力,当添加0．3％次黄嘌呤时,可获得高于对照93．3％的肌苷产量,但转化率以添加0．1％次黄嘌呤时为最高。     

新型肌苷产生菌──产氨短杆菌GMBA—800选育和特性的初步研究

采用多种方法诱变获得一株新型肌苷产生菌──产氨短杆菌（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）ＧＭＢＡ－８００（具有腺嘌呤、生物素双重营养缺陷型和对８－氮杂鸟嘌呤、磺胺胍、６－流基嘌呤有抗性）,对其生长和发酵条件进行初步研究。肌苷产量从５ｇ／Ｌ提高到１８．４１ｇ／Ｌ,发酵周期从８４ｈ缩短为６３ｈ。菌株遗传性状稳定。     

米曲霉尿嘧啶营养缺陷型突变体筛选及转化体系建立

米曲霉(Aspergillus oryzae)是一种十分重要的工业微生物，但由于其菌丝体和孢子均含有多个细胞核，并且对多种抗性药物具有抗性，导致其遗传转化和分子生物学研究较其他模式丝状真菌困难。目前米曲霉遗传转化主要采用营养缺陷型作为筛选标记。尿嘧啶营养缺陷型是米曲霉转化中最常用的一种营养缺陷型标记，其筛选标记基因pyrG编码乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶为尿嘧啶的前体尿苷合成所必需。本研究以米曲霉3.042为背景，利用紫外线诱变和5-氟乳清酸(5-FOA)胁迫筛选获得5株尿嘧啶营养缺陷型菌株，经DNA测序5株菌株均为pyrG基因不同位点突变，确定为尿嘧啶营养缺陷型。以筛选到的尿嘧啶营养缺陷型菌株为背景，利用农杆菌介导的米曲霉转化系统，成功构建了米曲霉尿嘧啶营养缺陷型为筛选标记的农杆菌转化体系。     

酿酒酵母ADH3基因的敲除

设计含有与酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)编码乙醇脱氢酶Ⅲ的ADH3基因ORF两侧序列同源的长引物,以质粒pUG6为模板进行PCR构建带有Cre/loxP系统的敲除组件。转化酿酒酵母YS3(Saccharomyces cerevisiae),并将质粒pSH65转入阳性克隆子。半乳糖诱导表达Cre酶切除Kanr基因,在YPD培养基中连续传代培养丢失pSH65质粒,在原ORF处留下一个loxP位点,获得ADH3单倍体缺陷型菌株。利用同样的方法再次敲除双倍体的另一个等位基因。最终获得ADH3双倍体基因缺陷型突变株YS3-ADH3。     

腺嘌呤对枯草杆菌GMI—971发酵生产肌苷的影响

培养基中腺嘌呤含量对腺嘌呤缺陷型的枯草杆菌GMI－971发酵产肌苷有显著影响。在拟定条件下,腺嘌呤浓度在150mg／L时摇瓶肌苷产量最高。对不同来源的四种酵母粉分别添加腺嘌呤,当其含量增加至l50ml／L时,肌苷产量也最高。     

枯草杆菌JSIM-1019突变株肌苷发酵研究

以肌苷产生菌枯草杆菌7171-9-1为出发菌株,经物理、化学诱变剂连续处理,获得一株腺嘌呤、组氨酸、硫胺素三重营养缺陷型并对8-氮杂鸟嘌呤、6-巯基嘌呤有双重抗性的突变株JSIM-1019。在摇瓶和发酵罐试验中,该变异株的肌苷产量显著高于亲株。摇瓶试验产肌苷达20g/L,最高可达24.83g/L。工业生产试验最高达14.5g/L,稳定在12g/L。发酵周期平均为43.8小时。菌株遗传性状稳定。     

采用Red重组系统构建包装菌株DH-gⅢ

选择感染性噬菌体技术是研究蛋白相互作用的良好手段,获得基因Ⅲ缺陷的辅助噬菌体是构成SIP体系的关键.为制备基因Ⅲ缺失的辅助噬菌体,利用λRed重组系统将完整的噬菌体基因Ⅲ和氯霉素抗性基因整合到大肠埃希菌DH5α的染色体上组氨酸操纵元位点构建包装菌株,经氯霉素抗性筛选并用PCR及组氨酸表型鉴定,获得包装菌株DH-gⅢ;将缺失功能基因Ⅲ的缺陷型噬菌体基因组转化到包装菌株中培养制备辅助噬菌体,以集落形成试验来检测缺陷型噬菌体的感染能力,结果滴度可达到4.3×108,只具备一次感染力,表明包装菌株构建成功,能用来制备辅助噬菌体,有望用于SIP体系.     

5-氨基-4-氨甲酰咪唑核苷产生菌AIC-90菌种选育研究

已肌苷产生菌枯草杆菌GMI- 741(Ade - )为出发菌株 ,通过多因子诱变选育出具有非精确嘌呤缺陷型、丧失腺嘌呤脱氨酶的AICAR(5 -氨基 - 4-氨甲酰咪唑核苷 )产生菌AIC - 90 ,该菌株摇瓶发酵 72h产AICAR可达 2 0 .3g/L以上。     

枯草杆菌(Bacillus subtilis)转化的研究I．受体菌株的筛选

混合两个枯草杆菌抗链霉素突变体的核酸,对149株枯草杆菌进行转化试验,筛选到Ki-2为一可转化的受体菌株。用紫外线诱变,从Ki-2获得的9个营养缺陷型其中包括尿嘧啶、异亮氨酸、褓氨酸、苏氨酸、撷氨酸加异亮氢酸、苏氧酸加蛋氦酸、辙氨酸加亮氨酸加异亮氨酸、苏氨酸加异亮氨酸加檄氨酸、苏氨酸加亮氧酰加异亮氨酸加颛氯酸的缺陷型各一个,都可进行转化。以单独核酸分刖进行转化试验表明,四个抗链霉素突变体中,有一个不能作耠体。观察了有转化活性的DNA与无转化活性的DNA按不同比例混合后对转化作用的影响。讨论了用混合不同耠体核酸从大量菌株中簖选受体菌株的方法。     

一种快速、精确构建大肠杆菌组氨酸营养缺陷型的方法

将表达Red体内重组蛋白的质粒pKD46转化大肠杆菌：DH5α,用5′端与组氨酸基因同源,3′端与卡那霉素抗性基因同源的引物获得具有卡那霉素抗性基因的PCR产物,然后电击转化DH5α,在λRed重组系统的帮助下,通过卡那霉素抗性基因两侧的组氨酸基因序列在体内与大肠杆菌染色体上的组氨酸基因发生同源重组,置换了DH5α组氨酸操纵元中的hisDCB基因,最后利用卡那霉素抗性基因两端的FRT位点,通过FTP位点专一性重组将卡那霉素抗性基因去除,最终获得了不具抗性的大肠杆菌组氨酸营养缺陷型菌株。为在大肠杆菌及其他菌株中快速、精确的构建营养缺陷型菌株提供了有益的参考。     

利用可重复使用的URA3标记基因建立热带假丝酵母基因敲除系统

热带假丝酵母(Candida tropicalis)在发酵工业中具有重要的应用潜力,但二倍体遗传结构和较低的遗传转化效率限制了其代谢工程育种技术的应用。建立可靠的遗传转化技术并高效的删除目的基因是代谢工程改造热带假丝酵母的重要前提。文章以C. tropicalis ATCC 20336为出发菌株,通过化学诱变筛选获得了尿嘧啶缺陷型突变株C. tropicalis XZX(ura3/ura3)。以丙酮酸脱羧酶(Pyruvate decarboxylase,PDC)基因作为靶基因构建了两端包含同源臂并在选择性标记C. tropicalis URA3(Orotidine-5′-phosphate decarboxylase,乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶)基因两侧同向插入源于沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的hisG序列的基因敲除盒PDC1-hisG-URA3-hisG- PDC1(PHUHP),并转化宿主菌株C. tropicalis XZX,筛选获得PHUHP片段正确整合到染色体的PDC基因位点的转化子XZX02。在此基础上,将转化子XZX02涂布于5-FOA(5-氟乳清酸)选择培养基上,筛选得到URA3基因从PHUHP片段中丢失的营养缺陷型菌株XZX03。进一步构建了第2个PDC等位基因的删除表达盒PDCm- URA3-PDCm,并转化C. tropicalis XZX03菌株,获得转化子C. tropicalis XZX04。经PCR和DNA测序确认转化子C. tropicalis XZX04细胞染色体上的两个PDC等位基因被成功敲除。文章建立了一种营养缺陷型标记可重复使用的热带假丝酵母遗传转化技术,利用该技术成功敲除了细胞的PDC基因,为进一步利用代谢工程改造热带假丝酵母奠定了基础。     

枯草芽孢杆菌突变体在合成培养基中的生长和肌苷合成的研究

用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)产肌苷突变体24—36,在合成培养基巾探讨了核陵碱基等成份对肌苷积聚的影响,结果表明： 1．在所试验的7种碱基中,腺嘌呤对肌苷积聚影响最大,它的最适含量为200毫克／升,超过400毫克／升时肌苷积聚显著降低,但生长量达到最大值。 2．在腺嘌呤含丘为200毫克／升的培养基中加入适量尿嘧啶能促进菌帮本生长和肌侍积聚。 3．在腺嘌呤过量存在时,加入0．3％次黄嘌呤,肌苷积聚量可达最适腺螵呤时的合成量。 4．硫胺素营养缺陷型与其自发回复突变株积聚肌苷的能力无明显区别。 5．葡萄糖,(NH4)2SO45尿 素。L-谷氨酸对该菌生长和肌苷积聚均有一定影响,但以L-谷氨酸庄培养基中的含量影响最大。     

抗药性突变肌苷高产菌的选育

以枯草芽孢杆菌(Bacillur subtilis)22为出发菌株,经紫外线诱变,分别获得对链霉素(Sm)、盐酸羟胺(Hc)、叠氮化钠(Sa)有抗性的突变株,产肌苷均明显高于出发株。其中链霉素抗性突变株Sm-37-18产肌苷最高,在最佳发酵条件下,产肌苷达19.49g/L,较出发株提高38.4%,发酵周期由60小时缩短至48小时。     

利用营养缺陷诱变对金顶侧耳进行基因连锁分析研究

利用金顶侧耳的营养缺陷型菌株配制杂交菌株,通过营养缺陷型标记对其后代进行连锁分析,确定不亲和性因子和营养缺陷标记所在的连锁群及其排列顺序。截止目前的试验数据表明,金顶侧耳至少由6条染色体(连锁群)组成。其中A因子存在的第1连锁群上分布着ade2、pab1、ade5、met2、met7营养缺陷型基因位点;B(Bα、Bβ)因子存在的第2连锁群上分布着cho1、ade1营养缺陷型基因位点;第3连锁群上分布着met9、arg1、his1、ade7、his3、met1营养缺陷型基因位点;第4连锁群分布着nic1、nic2、ade4、pdx2营养缺陷型基因位点;第5连锁群分布着pan1、ino1营养缺陷型基因位点;第6连锁群分布着ile1营养缺陷型基因位点。金顶侧耳与其他担子菌的遗传图谱相同,第1连锁群A因子附近均分布着Ade及Pab营养缺陷型基因位点。     

肌苷产生菌B.Subtilis H841在2升罐中的发酵

枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)H841肌苷产生菌是腺嘌呤、组氨酸、硫胺素三重缺陷型菌株,并对8—氮杂乌嘌呤、6—巯基嘌呤有抗性。在摇瓶中产肌胺18.1克/升,在2L自控发酵罐中最高可产肌苷19.6克/升,在流加葡萄糖情况下可产肌苷26.2克/升。控制pH较不控制pH发酵肌苷产量有较大的增加,控制pH发酵并补加营养时,肌苷产量可稳定地增长,但对葡萄糖的转化率是相同的。     

一个推测的拟南芥漆酶基因在巴斯德毕赤酵母中的表达

At5g01040基因是一个推测的拟南芥漆酶基因。根据其编码序列设计引物,利用RT—PCR方法扩增出1755bp的片段。测序结果表明,该片段存在3个突变位点,其中一个突变位点改变了所编码的氨基酸。将该片段克隆到表达载体pPICZaB上,电击转化毕赤酵母。经筛选获得80个候选重组菌株,其中18个菌株的培养液中存在漆酶活性,说明所克隆的基因在毕赤酵母中实现了分泌表达,证实了At5g01040编码的蛋白具有漆酶活性。     

利用Red重组系统对大肠杆菌ClpP基因的敲除

利用含有质粒pKD4 6的菌株BW2 5 113,在阿拉伯糖诱导后 ,表达λ噬菌体的 3个重组蛋白 ,宿主菌就具有了同源重组的能力 .设计的引物 5′端有 5 0bp的拟敲除基因的同源臂 ,3′端为扩增引物 ,以pKD3为模板 ,扩增两侧含FRT位点的氯霉素抗性基因 ,将此线性片段电转入具重组功能的感受态细胞 ,利用氯霉素平板就可以筛选到阳性转化体 .再利用表达Flp重组酶的质粒pCP2 0 ,可将FRT位点之间的氯霉素抗性基因删除 .利用该重组系统 ,构建了ClpP蛋白酶缺失的大肠杆菌工程菌株 ,可望在减少外源蛋白的降解方面发挥一定的作用 .     

用绿色荧光蛋白监测转基因植物中选择标记基因的消除

绿色荧光蛋白(GFP)可直接进行活体观察,它的这个优点可被用于监测转基因植物中选择标记基因的消除。为此,构建了植物表达载体pGNG,将绿色荧光蛋白基因(gfp)和卡那霉素抗性基因表达盒(NosP-nptll-NosT)一起克隆在两个同向的lox位点间,在第一个lox位点上游置有CaMV 35S启动子以驱动GFP表达,第二个lox位点下游置有不含启动子的大肠杆菌β-葡萄糖醛酸酶(GUS)基因。首先在含卡那霉素(Kan)的培养基上筛选出转pGNG的烟草,借助绿色荧光可容易地检出表达GFP的转化体。然后用另一转化载体pCambia1300Cre二次转化表达GFP的转基因植物,利用另一选择标记基因潮霉素抗性基因(hpt)进行筛选,在获得的再生植株中,Cre重组酶的表达消除了转化体中两lox位点间的gfp和nptll。实验结果表明可借助GFP荧光的消失,快速选出nptII被消除的二次转化体,同时GUS(作为目的蛋白) 在CaMV 35S启动子驱动下获得表达。最后利用后代的分离将hpt和cre除去。