珠蛋白mRNA的分离和cDNA的合成

本文报道从人工贫血的兔与鸡的网织红细胞中提取珠蛋白mRNA,在麦胚无细胞体系中测定其蛋白翻译活力,与对照相比,兔、鸡珠蛋白mRNA促进~(14)C-亮氨酸参入新生蛋白质的活力分别达到32倍和10倍,所翻译的蛋白产物在聚丙烯酰胺凝胶上的行为与天然珠蛋白一致。上述mRNA在AMV反转录酶和DNA聚合酶的作用下,分别合成了单链和双链的cDNA及mRNA-cDNA杂交链,凝胶电泳分析其长度分别为500～700,550～800及500～800碱基对,550～800碱基对大小的双链cDNA约占总合成量的30%。     

北京鸭珠蛋白mRNA的分离纯化及其cDNA的合成

 从人工贫血的北京鸭网织红细胞中直接提取总RNA,经Oligo(dT)-纤维素柱层析分离获得珠蛋白mRNA,并经蔗糖密度梯度离心首次得到了电泳单一条带的北京鸭球蛋白mRNA。从凝胶电泳以及蔗糖密度梯度离心鉴定其沉降系数为9S。在麦胚无细胞体外翻译体系中测定了它们的蛋白翻译活力。鸭珠蛋白mRNA促进了~3H-亮氨酸参入新生蛋白的活力,达到对照组的10倍。所翻译的蛋白产物在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上的电泳行为与天然鸭珠蛋白一致。 经Oligo(dT)-纤维素及蔗糖密度梯度离心提纯的珠蛋白mRNA,在AMV反转录酶及DNA聚合酶的作用下,分别合成了单链及双链cDNA。其双链链长,经凝胶电泳分析,约为500碱基对。     

猪垂体总mRNA的提取、鉴定及其cDNA的合成

 用改进的LiCl沉淀法和寡聚(dT)-纤维素亲和层析法由猪垂体制得总mRNA。在兔网织红细胞无细胞翻译体系中进行体外翻译的结果表明,制得的总mRNA具有一定的翻译活力。翻译产物与兔抗猪生长激素抗血清发生免疫沉淀,沉淀物占总翻译产物的10％左右。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果表明翻译产物有一条很深的带,分子量约为24,000道尔顿,与猪前生长激素的分子量相近。以制备的mRNA为模板反转录合成了双链cDNA。第一链的合成产率为10—35％,第二链的合成产率为84—115％。cDNA的平均分子长度为825bp。     

野生大豆未成熟种子总mRNA的分离及其cDNA的分子克隆

用氯化锂沉淀法从野生大豆(G.soja)未成熟种子中制备总RNA,经oligo(dT)-纤维素柱亲和层析,获得总mRNA,在兔网织红细胞体系中表现出一定翻译活性。以总mRNA为模板,oligo(dT)_(12)(?)为引物,反转录酶催化合成第一链cDNA,RNase H-DNA聚合酶Ⅰ协同合成第二链cDNA。双链cDNA的长度大约为200—5000 bp,且不存在发夹结构。将双链cDNA修补后钝端连接到pUC 19质粒的Sma 1位点,转化E.coli JM107,获得800多个白色重组子克隆。快速电泳检测及酶切分析表明,多数重组子带有插入片段,其中3个重组子的插入片段长度大致为1700 bp、2600 bp和1400 bp。     

人珠蛋白信使核糖核酸的制备及其体外翻译

本文以新生儿ABO血型不配溶血换得的血网织红细胞为材料,用酚-氯仿提取及Oligo(dT)纤维素亲和层析制备了人珠蛋白mRNA。并在变性条件下经琼脂糖凝胶电泳鉴定,证明它是9～10S的RNA。人珠蛋白mRNA在兔网织红细胞溶解物与麦胚体外翻译体系中的翻译活性与其浓度均有依赖关系。用SDS-聚丙烯酰胺凝胶不连续电泳及萤光显影鉴定了无细胞体系的翻译产物为人珠蛋白;并以醋酸纤维膜电泳分析了体外合成的人珠蛋白肽链组成,结果表明新生儿血中珠蛋白mRNA合成的α、β、γ珠蛋白肽链之比为3:1:2。     

人珠蛋白信使核糖核酸的制备及其体外翻译

本文以新生儿ABO血型不配溶血换得的血网织红细胞为材料,用酚-氯仿提取及Oligo(dT)纤维素亲和层析制备了人珠蛋白mRNA。并在变性条件下经琼脂糖凝胶电泳鉴定,证明它是9～10S的RNA。人珠蛋白mRNA在兔网织红细胞溶解物与麦胚体外翻译体系中的翻译活性与其浓度均有依赖关系。用SDS-聚丙烯酰胺凝胶不连续电泳及萤光显影鉴定了无细胞体系的翻译产物为人珠蛋白;并以醋酸纤维膜电泳分析了体外合成的人珠蛋白肽链组成,结果表明新生儿血中珠蛋白mRNA合成的α、β、γ珠蛋白肽链之比为3:1:2。     

利用SMART技术构建鸡肺酵母双杂交cDNA文库

以1月龄SPF鸡肺为材料,用Trizol方法提取总RNA,并用mRNA纯化试剂盒纯化PolyA+mRNA,利用SMART技术合成双链cDNA(ds cDNA).合成的ds cDNA通过CHROMA SPINTM TE-400 Column进行纯化,纯化后的ds cDNA与线性pGADT7-Rec共转化酵母感受态细胞AH109中,以同源重组的方式,在酵母细胞内构建成鸡肺的cDNA文库.获得的文库容量为3.9 × 106 cfu,随机选取20个克隆进行PCR检测,插入片段大小集中在0.3～3.0 kb之间,平均插入片段约为1.4 kb左右,文库重组率为100％.结果表明该文库达到了高质量文库所应具备的条件,为酵母双杂交技术筛选与IBV-N相互作用的宿主细胞蛋白奠定基础.     

鲤鱼垂体mRNA反转录模板活性的研究

 本实验用不同方法研究鲤鱼垂体mRNA反转录为互补DNA的活性。用硫氰酸胍法,从垂体中提取总RNA,经过Oligo(dT)-纤维素柱层析,得到poly(A)~+RNA。 以mRNA为模板,30％反转录成单链cDNA。利用RNaseH-DNA聚合酶Ⅰ-E.coli DNA连接酶合成双链cDNA。单链cDNA拷贝成双链cDNA。经放射自显影分析,证明合成了全长cDNA。用水解法合成双链cDNA,大多数为不完整的双链cDNA。平末端的双链cDNA连接上Eco RI-linker经Sepharose-4B分离,收集大片段cDNA,与pUC 19载体相连接,经转化构建成10~5克隆/μg mRNA的cDNA文库。     

cDNA合成和产量计算

以信使核糖核酸(mRNA)为模板合成互补的DNA链(cDNA),并以此单链DNA合成双链cDNA的技术是基因工程中最初的和重要的环节之一。本文根据研究工作的体会介绍cDNA合成方法,产量计算,影响cDNA合成的因素和解决的方法。一、cDNA合成方法自从1970年Temin和Baltimore 发现鸡骨髓瘤病毒逆转录酶以后,以mRNA为模板合成cDNA的技术很快应用到基因工程研究中。由于大多数合成反应都以polyA-mRNA为模板,因此需要加入寡聚脱氧胸腺核苷酸作为引物。底物是四种脱氧核苷三磷酸,其中一种     

SPF鸡肝脏细胞cDNA文库的构建及鉴定

旨在构建SPF鸡肝脏组织细胞的cDNA文库并且对文库质量进行鉴定。用TRIzol方法从SPF鸡肝脏组织细胞中提取总RNA,用紫外分光光度仪测定其含量后,应用SMART技术经过LD-PCR合成双链cDNA。利用CHROMA SPIN-400纯化柱纯化得到双链cDNA,并与线性pGADT7-Rec共转化进酵母Y187感受态,以同源重组的方式在酵母细胞内构建鸡肝脏酵母双杂交cDNA表达文库。结果显示,成功构建含有1.70×10~7个重组子的SPF鸡肝脏细胞cDNA文库,插入片段多数在0.4~2.0 kb之间,重组率达100%,重组子中平均插入的片段长度为1.0 kb,文库滴度为1.30×10~7 cfu/mL。结果表明,该文库达到了高质量文库所应具备的条件,为进一步筛选此文库与ARV相互作用的宿主蛋白以及研究其功能提供了数据依据。     

[D丙~6,脯~9乙基胺]-促黄体素释放激素LH-RHA对妊娠兔子宫内膜多聚核糖体mRNA的作用

本实验制备了非孕兔、孕兔和绐孕兔注射高剂量[D丙‘,脯’乙基胺]-促黄体素释放激素(LH-RH A)不同天数的子宫内膜多聚核糖体,并从多聚核糖体提取mRNA,在网织红细胞无细胞翻译系统中测定了活性。结果指出用LH-RH A处理后多聚核糖体mRNA量减少,其翻译活性降低,在体内实验中核糖体mRNA诱导兔子宫分秘蛋白的合成也受到抑制,特别是分子量大约为22,000和69,000左右的分泌蛋白合成受到明显抑制。     

人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)mRNA5′端非翻译区(UTR)对其表达的调控

运用反转录-PCR技术,从黑色素瘤细胞中扩增出t—PA cDNA 5′末端460bp的片段,再经重组获得含完整5′-UTR的t—PA cDNA克隆,在兔网织红细胞裂解物中翻译和COS-7细胞中表达发现,t—PA mRNA 5′—UTR对其表达有明显的抑制作用。将t—PA mRNA 5′—UTR用苜蓿病毒RNA 5′—UTR替换,使t—PA的表达水平提高3-7倍,mRNA翻译起始区二级结构分析结果表明,翻译起始区的二级结构与t-PA的表达水平有关。     

对tRNA和mRNA双依赖的兔网织红细胞无细胞蛋白合成体系的制备

本文在Gilbert和Anderson及Pel-ham和Jackson方法的基础上加以改进,制备了一个对tRNA和二RNA双依赖的兔网织红细胞无细胞蛋白合成体系。在有TMV RNA存在的情况下,加入兔网织红细胞总tRNA,氨基酸参入比不加tRNA的对照高40倍以上。在有兔网织红细胞总七RNA存在的情况下,加入TMVNA或Poly(rU),氨基酸参入分别比不加外源mRNA的对照高10倍和7倍以上。这个双依赖的无细胞蛋白合成体系是检测单一tRNA和mRNA生物活性的有用工具。     

家蚕(Bombyx mori)主要血浆蛋白质及其基因表达的研究

本文用SDS-PAGE法观察不同发育阶段蚕血液中主要血浆蛋白质sp、30KP浓度的变化;从不同发育阶段的蚕脂肪体提取RNA和poly(A)~+-RNA,在兔网织红细胞系作体外翻译并检测翻译产物。结果表明,5龄蚕脂肪体mRNA合成蛋白质的速率为初蛹的2倍;5龄及初蛹脂肪体30KP mRNA活性的发育变化与其相应蛋白质在血液中的浓度变化一致;sp-1在5龄幼虫脂肪体内的表达及卵黄原蛋白(Vg)在蚕蛹脂肪体内的表达具有雌特异性,其表达和性特异性大体是在前翻译水平被调节的。     

cDNA的合成与克隆

多聚(A)~+mRNA在逆转录酶作用下合成出双链cDNA及将此cDNA插入到细菌质粒中去已成为真核生物分子生物学研究中的一种基本技术。     

mRNA翻译起始区二级结构优化提高(R)-羰基还原酶的表达及催化效率

为了提高近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis CCTCC M203011)的(R)-羰基还原酶在大肠杆菌中的表达水平及催化效率,对酶编码基因mRNA翻译起始区中+1～+78区进行二级结构的优化,并构建了相应的突变体。优化后mRNA翻译起始区的发夹结构明显减少,自由能显著下降(由原始的?9.5kcal/mol降至?5.0kcal/mol),使酶蛋白的表达水平及粗酶比活力分别比优化前提高了4～5倍和61.9%。在高底物浓度(5.0g/L2-羟基苯乙酮)下,优化突变株不对称转化效率较高,产物(R)-苯基乙二醇的光学纯度和产率分别为93.1%e.e.和81.8%,比优化前提高了27.5%和40.5%。研究结果表明:优化mRNA翻译起始区的二级结构,克服蛋白翻译启动的空间位阻,不仅能促进翻译的顺利进行,使目标蛋白得到高效表达,而且有利于蛋白空间结构的正确折叠,有效提高酶蛋白活力及生物催化功能。     

芜菁花叶病毒（TUMV）核酸cDNA的合成与克隆

从接种芜菁花叶病毒后发病芥菜(Brassica Juneaen)中提取病毒,然后提取其核酸(TuMV-RNA)。以纯化的TuMV-RNA为模板,以Oligo(dT)_(12-18)及小牛胸腺DNA水解物为引物,合成双链cDNA,双链cDNA长度约500—4300bp。将双链cDNA补齐后,钝端连接到pUC19质粒的Smal位点,转化E.coli DH,获得500多个白色克隆。菌落原位杂交及酶切分析表明,重组质粒中的插入片段大多数为芜菁花叶病毒RNA的互补DNA,长度为500—4000bp。     

萘胁迫下水稻幼苗抑制差减杂交cDNA文库构建

从200mg/Kg萘胁迫水稻幼苗根系中成功分离和纯化了高纯度的总RNA和mRNA,并以无萘处理为Driver,以200mg/Kg的幼苗为Tester,通过cDNA双链的合成及两次PCR扩增,富集到两组处理中差异表达的大小在200～800bp的cDNA序列,pGEMT的连接和蓝白斑筛选表明杂交文库滴度和重组率分别达到1.5×106 pfu/mL和96%,共收集阳性克隆8000个,形成了抑制消减杂交的质粒cDNA文库.随机挑取酶切质粒的电泳分析表明,载体中均有插入片段.高效抑制消减杂交文库的建立为进一步分析基因的差异表达及分离萘胁迫下抗性基因奠定了基础.     

红曲菌 cDNA 消减文库的构建

应用抑制性消减杂交技术,构建红曲菌产桔霉素和不产桔霉素差异表达的 cDNA 消减文库。分别从产桔霉素和不产桔霉素的红曲菌丝体中提取 mRNA,依次合成单链和双链 cDNA,经酶切成大小为 250～750bp 的片断,将产桔霉素的 cDNA 分为两组,分别与两种不同的接头连接,再与不产桔霉素的红曲菌的 cDNA 进行两次消减杂交及两次抑制性 PCR 后,将产物与 T/A 载体连接构建成功 cDNA 消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,文库扩增后得到 283 个克隆,经 PCR 法快速测定,均得到 250～750bp 的插入片断。所构建的红曲菌 cDNA 消减文库为进一步筛选红曲菌中与产桔霉素性状相关的基因奠定了基础。     

红曲菌cDNA消减文库的构建

应用抑制性消减杂交技术,构建红曲菌产桔霉素和不产桔霉素差异表达的cDNA消减文库.分别从产桔霉素和不产桔霉素的红曲菌丝体中提取mRNA,依次合成单链和双链cDNA,经酶切成大小为250～750bp的片断,将产桔霉素的cDNA分为两组,分别与两种不同的接头连接,再与不产桔霉素的红曲菌的cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR后,将产物与T/A载体连接构建成功cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,文库扩增后得到283个克隆,经PCR法快速测定,均得到250～750bp的插入片断.所构建的红曲菌cDNA消减文库为进一步筛选红曲菌中与产桔霉素性状相关的基因奠定了基础.