红曲菌cDNA消减文库的构建*

应用抑制性消减杂交技术,构建红曲菌产桔霉素和不产桔霉素差异表达的cDNA消减文库。分别从产桔霉素和不产桔霉素的红曲菌丝体中提取mRNA,依次合成单链和双链cDNA,经酶切成大小为250~750bp的片断,将产桔霉素的cDNA分为两组,分别与两种不同的接头连接,再与不产桔霉素的红曲菌的cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR后,将产物与T/A载体连接构建成功cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,文库扩增后得到283个克隆,经PCR法快速测定,均得到250~750bp的插入片断。所构建的红曲菌cDNA消减文库为进一步筛选红曲菌中与产桔霉素性状相关的基因奠定了基础。     

红曲菌cDNA消减文库的构建

应用抑制性消减杂交技术,构建红曲菌产桔霉素和不产桔霉素差异表达的cDNA消减文库.分别从产桔霉素和不产桔霉素的红曲菌丝体中提取mRNA,依次合成单链和双链cDNA,经酶切成大小为250～750bp的片断,将产桔霉素的cDNA分为两组,分别与两种不同的接头连接,再与不产桔霉素的红曲菌的cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR后,将产物与T/A载体连接构建成功cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,文库扩增后得到283个克隆,经PCR法快速测定,均得到250～750bp的插入片断.所构建的红曲菌cDNA消减文库为进一步筛选红曲菌中与产桔霉素性状相关的基因奠定了基础.     

肾癌相关基因克隆——肾癌cDNA消减文库的构建

应用抑制性消减杂交技术,构建人肾癌与正常肾差异表达的cDNA消减文库.分别从肾癌及正常肾细胞系中提取poly(A)⁺RNA,依次合成单链及双链cDNA,经酶切成平均大小为400～600 bp的片段,将肾癌cDNA分为两组,分别与两种不同的接头衔接,再与正常肾cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR后,将产物与T/A载体连接构建成功cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增.构建成功具有高消减效率的人肾癌cDNA消减文库,非特异性cDNA片段被有效地消减,特异表达的cDNA得到富集.文库扩增后得到6 500个克隆,随机挑取350个制备质粒,酶切分析均得到400～600 bp插入片段.所构建的人肾癌cDNA消减文库为进一步大批量筛选、克隆肾癌特异性表达的未知新基因奠定了基础.     

一种用少量标本快速构建老年性白内障消减cDNA文库的方法

为从少量标本中获得含较多大片段的、高质量的老年性白内障消减cDNA文库,利用磁珠分离、生物素标记的改良消减杂交法获得差异cDNA,利用选择性PCR法扩增其中大片段差异cDNA,从而成功构建老年性白内障消减cDNA文库.在文库中随机挑取的22个克隆中,1 000 bp以上的片段有7个,占31.8%,750 bp以上有15个,占68.2%.所得cDNA片段较大,可以满足下一步研究需要.改良消减杂交法结合选择性PCR法可以从少量标本中快速有效地获得大片段高质量的消减cDNA文库.     

应用抑制性消减杂交技术研究大鼠肝脏热应激过程中基因的差异表达

目的：应用抑制性消减杂交技术,分离热应激过程中出现的差异表达基因,筛选与热应激相关的功能基因片断,探索热应激的分子机理。方法：实验分两组：热应激组和常温对照组,分别提取肝组织mRNA后反转录cDNA。内切酶酶切、接头连接后,以热应激组cDNA为tester,对照组cDNA为driver进行SSH。产物克隆T／A载体构建重组质粒转化感受态细胞后进行分离筛选。结果：mRNA质优量足,反转录cDNA并成功酶切为500bp左右片断。连接效率满意。高效杂交后成功构建消减文库,并初步从中分离获得180个片段。结论：应用SSH技术构建热应激差异表达基因消减文库为筛选热应激相关基因奠定了基础,对探索支配热应激反应的功能基因有积极意义。     

用改良消减杂交结合选择性PCR法构建老年性白内障消减cDNA文库

为构建含较多大片段的高质量的老年性白内障消减cDNA文库 ,利用生物素标记、磁珠分离的改良消减杂交法获得差异cDNA .利用选择性PCR法扩增其中大片段差异cDNA ,将其与T 载体进行T A连接并转化入大肠杆菌 ,成功构建老年性白内障消减cDNA文库 .共获得 4 0 0 0余个克隆 ,随机挑取的 2 2个克隆中 ,≥ 10 0 0bp的片段有 7个 ,占 31 8% ,≥ 75 0bp有 15个 ,占 6 8 2 % .将≥ 75 0bp的 15个克隆进行反向点杂交 ,排除其中假阳性克隆 ,阳性克隆经测序并与GenBank比较 ,得到 6个已知基因、1个新基因 ,6个已知基因中 4个为全长基因 ,说明所得cDNA片段较大 ,文库质量较高 .改良消减杂交法结合选择性PCR法可以快速有效地获得大片段高质量的消减cDNA文库 ,为进一步筛选、鉴定老年性白内障致病相关基因奠定了基础     

用少量样本进行抑制性消减杂交

利用根据cap-finder方法建立的全长cDNA合成技术,扩增获得了恒河猴着床点子宫内膜组织表达mRNA的双链cDNA,通过抑制性消减杂交,成功地构建了恒河猴着床点消减文库.随机挑选文库中的阳性克隆,经点杂交证明27％为着床点差异表达的克隆.由此表明抑制性消减杂交结合cap-finder扩增全长cDNA的方法,可以有效地从少量而珍贵的样本中获得高质量的消减文库.     

梅山猪与长白猪肌肉组织间正反向消减cDNA文库的构建

以梅山猪和长白猪的背最长肌为材料,利用抑制性消减杂交技术成功构建了梅山猪与长白猪肌肉组织间正反向消减cDNA文库。以管家基因G3PDH作为消减指标,检测梅山猪和长白猪两个消减文库的消减效率分别高达2^10和2^5倍,表明某些特异于两种肌肉组织的差异表达基因的富集效率也分别接近2^10和2^5倍。从两个消减文库中分别筛选到了。709和673个有效阳性克隆,PCR鉴定插入片段长度主要分布于150～750bp之间。不同猪种肌肉组织间消减cDNA文库的构建为进一步分离和鉴定与猪肌肉生长和肉质相关基因奠定了基础,对探讨肌肉生长机理和肉质决定因素以及猪的分子育种具有重要意义。     

沙田柚配子体自交不亲和花柱消减文库的构建及分析

分别以沙田柚自交花柱cDNA为tester,异交花柱cDNA为driver,利用抑制性消减杂交技术构建了消减文库,文库的重组率高于95%,插入片段集中在100～500 bp之间,对文库部分克隆进行测序并与GenBank中的同源序列进行比较,发现了一些类似于SI、S9-RNase、激酶类等与自交不亲和相关的基因.     

应用抑制消减杂交分离雌、雄鸡胚性分化早期的差异表达基因

分离不同性别的鸡胚性分化早期差异表达基因,可为禽类性别决定和性分化机制研究提供基本信息。本研究分别以孵化3.5-6d的雌、雄鸡胚性腺为材料,利用抑制性消减杂交技术成功构建了雌-雄鸡胚间正、反向消减cDNA文库,并利用斑点印迹杂交从中筛选出了39个性别差异表达的阳性cDNA克隆。以持家基因GAPDH为参照指标检测消减文库的消减效率,结果发现两个文库的消减效率均高达25倍。插入片段PCR鉴定结果显示,消减文库中cDNA插入片段的长度主要分布于250-750bp之间。分别对雌、雄鸡胚消减文库中的252和168个cDNA克隆进行斑点杂交筛选,再随机从两个消减文库中共抽取39个阳性差异表达克隆进行序列测定及序列比对分析。结果表明:这39个cDNA克隆分别代表了定位于鸡不同染色体上的18个已知功能的基因和11个假定基因;参照哺乳动物同源基因的功能,所得的18个已知差异基因可能参与多种生物反应过程。用半定量RT-PCR方法对雌、雄鸡胚消减文库中各5个基因的表达情况进行进一步验证,发现除雌性库中的一个基因外其它9个基因均有较明显的性别差异表达。这些性别差异表达基因的获得为进一步研究鸡胚性腺发育中的基因表达调控奠定了基础     

渗透胁迫下白花柽柳消减文库的构建及分析

用PEG6000对白花柽柳进行渗透胁迫,以其叶部cDNA为试验方（tester）,正常生长的白花柽柳叶部cDNA为驱动方（driver）,利用抑制性消减杂交技术（SSH）构建了渗透胁迫下白花柽柳的消减文库。提取重组质粒经PCR检测,插入片段大部分集中在250～650 bp之间。通过对文库阳性克隆的随机测序,获得了如脯氨酸转移蛋白、钙依赖蛋白激酶、亮氨酸拉链蛋白、类转录起始因子蛋白等23个与渗透胁迫有关的EST,它们涉及了植物的渗透调节、信号传递、基因调控、活性氧清除、新陈代谢等生理生化过程。     

抑制消减杂交和辐射小鼠血虚模型筛选"四物汤"诱导表达的基因

应用抑制性消减杂交技术构建受辐射小鼠血虚模型在中药四物汤诱导前后消减cDNA库,并从中克隆鉴定出与四物汤药效相关基因。从受辐射小鼠四物汤诱导前后骨髓细胞中提取mRNA并合成cDNA,分别作为tester和driver进行消减杂交及抑制性PCR,将PCR产物与载体连接构建cDNA库,高效电转化大肠杆菌进行库扩增,随机挑取其中的克隆进行酶切、测序分析。成功构建了具有高消减效率的受辐射小鼠四物汤诱导前后的消减cDNA库。库挑选得到512个阳性克隆。随机挑取30个插入片段测序,生物信息学分析结果显示大部分与红细胞分化、骨髓组织修复、结构重建有密切关系,其中8个为新基因片段。应用抑制性消减杂交技术所构建的受辐射小鼠四物汤诱导前后cDNA消减库为大批量筛选、克隆四物汤药效特异性相关基因奠定了基础。并从分子水平上发现四物汤对抑制凋亡、促进骨髓组织修复和结构重建、诱导红细胞分化的基因具有调节作用,可能和四物汤补血作用有关。     

萘胁迫下水稻幼苗抑制差减杂交cDNA文库构建

从200mg/Kg萘胁迫水稻幼苗根系中成功分离和纯化了高纯度的总RNA和mRNA,并以无萘处理为Driver,以200mg/Kg的幼苗为Tester,通过cDNA双链的合成及两次PCR扩增,富集到两组处理中差异表达的大小在200～800bp的cDNA序列,pGEMT的连接和蓝白斑筛选表明杂交文库滴度和重组率分别达到1.5×106 pfu/mL和96%,共收集阳性克隆8000个,形成了抑制消减杂交的质粒cDNA文库.随机挑取酶切质粒的电泳分析表明,载体中均有插入片段.高效抑制消减杂交文库的建立为进一步分析基因的差异表达及分离萘胁迫下抗性基因奠定了基础.     

SSH技术筛选β干扰素真核表达载体转染细胞的下调基因

筛选β-干扰素质粒转染下调相关基因。以β-干扰素表达质粒pcDNA3.1(-)-IFNβ转染HepG2细胞,同时以空载体pcDNA3.1(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,从中提取mRNA并合成cDNA,经RsaI酶切后将来自pcDNA3.1(-)转染的cDNA分成两组,分别与两种不同的接头adaptor1和adaptor2衔接,再与来自pcDNA3.1(-)-IFNβ转染的cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR后进行测序及同源性分析。成功构建人β-干扰素质粒转染下调相关基因差异表达的cDNA。所获得的50个克隆中,随机挑选37个克隆均含有插入片段,将这些克隆进行序列测定,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列,结果共获得22种编码基因,其中3种为未知功能的基因。筛选到的cDNA序列,包括与细胞生长调节、物质代谢和细胞凋亡密切相关的一些蛋白编码基因。     

SSH技术筛选β干扰素真核表达载体转染细胞的下调基因

筛选β-干扰素质粒转染下调相关基因.以β-干扰素表达质粒pcDNA3.1(-)-IFN β转染HepG2细胞,同时以空载体pcDNA3.1(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,从中提取mRNA并合成cDNA,经RsaI酶切后将来自pcDNA3.1(-)转染的cDNA分成两组,分别与两种不同的接头adaptor1和adaptor2衔接,再与来自pcDNA3.1(-)-IFNβ转染的cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR后进行测序及同源性分析.成功构建人β-干扰素质粒转染下调相关基因差异表达的cDNA.所获得的50个克隆中,随机挑选37个克隆均含有插入片段,将这些克隆进行序列测定,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列,结果共获得22种编码基因,其中3种为未知功能的基因.筛选到的cDNA序列,包括与细胞生长调节、物质代谢和细胞凋亡密切相关的一些蛋白编码基因.     

用抑制性差减杂交构建新疆Kaposi肉瘤差异表达基因文库

目的:分离卡波氏肉瘤(Kaposi′s sarcoma,KS)差异表达基因,并建立相应的cDNA文库,为从分子水平揭示KS发病机制打下良好的基础。方法:采集KS肉瘤及来源于同一患者的正常皮肤组织,抽提总RNA,经逆转录酶合成dscDNA,并经RsaⅠ酶切,与2种不同的接头衔接,分别以正常组织和肿瘤组织作为tester和driver,进行双向抑制性差减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH),初步筛选KS肉瘤与正常皮肤差异表达基因,将差异基因PCR扩增,产物与pGEM-Teasy克隆载体连接,转化DH5α大肠杆菌,采用蓝白斑筛选,获得白色阳性克隆菌落,并煮沸破菌,PCR扩增出未知基因片段。结果:差减得到差异基因片段多位于200~500bp,成功构建了2个分别代表在KS肿瘤组织中表达上调和下调的基因文库。结论:经双向抑制性差减杂交获得了KS差异表达基因文库。抑制性差减杂交是一种快速、方便、有效的建立差异基因文库的方法。     

双链RNA病毒诱导的牙鲆胚胎细胞差减cDNA文库的构建

以紫外线灭活的dsRNA病毒草鱼出血病病毒(GCHV)诱导和模拟诱导的牙鲆胚胎细胞为材料,利用抑制性差减杂交(SSH)技术,成功构建了双链RNA病毒诱导的牙鲆胚胎细胞(FEC)差减cDNA文库.以管家基因α-tublin作为差减指标,经检测,该文库差减效率达2 10倍,表明经病毒诱导后某些差异表达基因也得到了相应倍数的富集.将获得的cDNA片段连接到pGEM-T载体,PCR检测显示差减片段在250bp～2 000bp之间.该差减cDNA文库的构建为从分子水平研究牙鲆培养细胞对dsRNA病毒的免疫反应、以及进一步鉴定和克隆差异表达基因打下了坚实基础.     

BLyS改组噬菌体文库的构建及初步筛选

从质粒pT7474-BLyS及人胎脑cDNA文库中分别扩增出BLyS和APRIL基因,用DNase I消化后,回收小于50 bp的片断,用于DNA改组。PCR产物与噬菌体载体pfUSE5连接后,电转E.coliER2738获得改组文库。构建的改组文库库容量为8.9×105。对文库进行初步的筛选,获得了一个受体结合活性降低的突变克隆。成功构建了BLyS改组噬菌体文库,为蛋白结构与功能之间关系的深入研究打下了基础。     

双链RNA病毒诱导的牙鲆胚胎细胞差减cDNA文库的构建

以紫外线灭活的dsRNA病毒草鱼出血病病毒(GCHV)诱导和模拟诱导的牙鲆胚胎细胞为材料,利用抑制性差减杂交(SSH)技术,成功构建了双链RNA病毒诱导的牙鲆胚胎细胞(FEC)差减cDNA文库.以管家基因α-tublin作为差减指标,经检测,该文库差减效率达2 10倍,表明经病毒诱导后某些差异表达基因也得到了相应倍数的富集.将获得的cDNA片段连接到pGEM-T载体,PCR检测显示差减片段在250bp～2 000bp之间.该差减cDNA文库的构建为从分子水平研究牙鲆培养细胞对dsRNA病毒的免疫反应、以及进一步鉴定和克隆差异表达基因打下了坚实基础.     

柔嫩艾美耳球虫孢子发育阶段虫体抑制性消减文库的构建

为了分离鉴定柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)孢子发育阶段虫体的差异表达基因,分别以柔嫩艾美耳球虫未孢子化卵囊和孢子化卵囊为驱动组、子孢子为实验组,或未孢子化卵囊为驱动组、孢子化卵囊为实验组,利用抑制性消减杂交(SSH)技术,构建了2个子孢子cDNA消减文库和1个孢子化卵囊cDNA消减文库。随机从3个cDNA消减文库中分别挑取50个克隆,经PCR鉴定2个子孢子cDNA消减文库的重组率都为96%,孢子化卵囊cDNA消减文库的重组率为98%。从每个文库中随机挑取50个克隆测序,并进行同源性比较分析,结果显示:从孢子化卵囊cDNA消减文库中获得了13个单一有效序列,其中8个EST与已知蛋白同源性很高;从2个子孢子cDNA消减文库中共获得了40个单一有效序列,其中9个EST与已知蛋白同源,其余可能为柔嫩艾美耳球虫的新基因。这些结果为分离柔嫩艾美耳球虫新功能基因和进一步探索防治球虫病的方法提供了理论基础。