携带人NFBD1基因shRNA重组逆转录病毒载体的构建及鉴定

建立逆转录病毒介导的NFBD1基因RNA干扰表达体系,并观察其在宫颈癌SiHa细胞中对NFBD1表达的影响.将人NFBD1基因RNA干扰双链DNA片段重组到pSUPER Retro质粒中,构建携带人NFBD1基因RNA干扰的逆转录病毒载体pSUPER-shRNA-NFBD1,经PT67细胞包装后,产生的重组逆转录病毒感染宫颈癌细胞株SiHa细胞,并用嘌呤霉素筛选产生稳定的细胞克隆,用实时荧光定量PCR和Westernblotting检测细胞中NFBD1 mRNA和蛋白表达的变化.重组逆转录病毒质粒经测序鉴定正确;逆转录病毒感染SiHa细胞后用嘌呤霉素筛选出稳定的细胞克隆;实时荧光定量PCR和Westernblotting检测人NFBD1 mRNA和蛋白表达水平明显低于阴性对照组和未干扰组.携带人NFBD1基因RNA干扰双链DNA片段的逆转录病毒感染SiHa细胞后能明显抑制NFBD1 mRNA和蛋白表达,为进一步研究NFBD1在宫颈癌中的作用奠定了基础.     

稳定干扰核糖体蛋白RPS7基因表达的宫颈癌HeLa细胞株的建立

目的建立稳定抑制RPS7基因表达的宫颈癌HeLa细胞株。方法设计并合成靶向人RPS7基因的shRNA寡核苷酸片段,克隆到逆转录病毒载体pSIREN中,构建重组质粒pSIREN-RPS7-shRNA,转染293T细胞,将包装产生的重组逆转录病毒感染宫颈癌HeLa细胞,经嘌呤霉素筛选获得稳定的细胞克隆,用real-timePCR和Western印迹检测细胞中RPS7mRNA和蛋白表达水平。结果获得了经测序鉴定正确的重组逆转录病毒质粒,逆转录病毒感染HeLa细胞后用嘌呤霉素筛选出的稳定细胞中,RPS7mRNA和蛋白水平均显著低于干扰对照细胞。结论成功构建了靶向人RPS7基因的shRNA逆转录病毒载体,建立了稳定抑制RPS7基因表达的宫颈癌HeLa细胞株．为进一步研究RPS7在宫颈癌中的生物学功能和作用机制提供了可靠的细胞模型。     

人线粒体转录终止因子3基因RNA干扰表达载体的构建筛选与干扰效果评价

目的:构建人线粒体转录终止因子3(MTERF3)基因的短发夹RNA(shRNA)干扰表达载体,并在mRNA和蛋白质水平对其干扰效率进行验证,以检测和筛选出干扰效率最优的shRNA表达载体。方法:根据人MTERF3基因全长cDNA序列,利用Oligoengine在线软件设计4个shRNA序列,合成4条互补寡核苷酸链,退火成双链后克隆至psiU6.1载体,得到4个重组干扰质粒psi-MTERF3-1～psi-MTERF3-4,并通过PCR和DNA测序对其进行鉴定;将重组干扰质粒利用脂质体介导瞬时转染He La细胞,转染48 h后采用real time RT-PCR检测4个干扰质粒对MTERF3 mRNA表达水平的影响,采用Western印迹检测其对MTERF3蛋白表达水平的情况,并筛选出最有效的shRNA干扰质粒。结果:PCR鉴定和DNA测序鉴定证实重组质粒中已插入目的DNA序列;real time RT-PCR和Western印迹结果表明4个重组载体均可以显著降低人MTERF3基因mRNA和蛋白质的表达水平(P0.05),其中以pSi-MTERF3-4的干扰效率最优,对MTERF3 mRNA表达的抑制率为70.1%,对MTERF3蛋白表达的抑制率为72.2%。结论:在人宫颈癌He La细胞系筛选出有效干扰MTERF3基因表达的shRNA序列,构建了针对MTERF3基因的RNA干扰真核表达载体且能够有效抑制目的基因的表达,为进一步研究人MTERF3在宫颈癌发生发展中的作用机制提供了实验基础。     

携带HSV-1TK基因的逆转录病毒载体构建及在HeLa细胞中的表达

目的:构建携带单纯疱疹病毒脱氧胸腺嘧啶激酶基因(herpes simplex virus thymidine kinase,HSV-TK)的逆转录病毒,用于宫颈癌的治疗研究。方法:用限制性内切酶从质粒pcDNA3.1/HA-myc-His(-)Z-TK切下HSV-1TK cDNA序列,亚克隆入逆转录病毒载体pLXSN得到重组质粒pLXSN-TK,鉴定正确的阳性重组质粒经PA317细胞包装,G418筛选,在NIH3T3细胞进行病毒滴度测定。然后用病毒感染人宫颈癌细胞HeLa。PCR、RT-PCR和Western blotting方法检测HSV-1TK基因在HeLa中的整合和表达情况。结果:重组质粒pLXSN-TK经PA317细胞包装后收获病毒上清,感染HeLa细胞,检测发现HSV-1TK基因整合到细胞基因组DNA中,并且能有效的转录和翻译。结论:成功构建了逆转录病毒pLXSN-TK,该病毒能有效感染HeLa细胞,并使携带的治疗基因HSV-1TK在细胞中表达,为今后HSV-1TK基因治疗宫颈癌的研究奠定基础。     

逆转录病毒载体介导的RNAi抑制乳腺癌细胞BSP基因表达

目的构建抑制人日5P基因表达的RNA干扰逆转录病毒载体,筛选建立稳定抑制BSP表达的MDA-MB-231BO细胞系。方法构建靶向人BSP基因的逆转录病毒重组质粒pSilencer—BSP27、pSilencer—BSP81和pSilencer—BSP100。将其包装成病毒后感染MDA—MB-23180细胞。用RT—PCR和Western印迹检测成功感染细胞（231BO．BSP27、231BO．BSP81、231BO—BSP100细胞）BSP基因的抑制效果。结果双酶切和测序结果显示重组核酸片段序列与设计的序列完全相同。RT—PCR和Western印迹结果显示231BO—BSP27、BO—BSP81和231BO—BSP100细胞BSP基因在mRNA水平和蛋白水平抑制效率分别为：70．8％、79．4％和30．1％：69．3％,75．2％和27．8％。结论成功构建抑制人BSP基因表达的RNAi逆转录病毒载体pSilencer．BSP27、pSilencer．BSP81和pSilencer—BSP100。获得高效稳定抑制BSP表达的231BO—BSP27、231BO．BSP81细胞系。     

针对核因子-κBP65基因的短发夹干扰RNA逆转录病毒载体构建与鉴定

目的：构建针对人核因子κB亚基P65基因mRNA的短发夹干扰RNA（shRNA）逆转录病毒表达载体,并探讨小干扰RNA（siRNA）靶向抑制NF—κB P65基因表达的作用。方法：根据shRNA设计原则,在人NF-κB P65全长序列中选取含19个核苷酸靶序列,设计形成siRNA的DNA模板并克隆到shRNA表达载体pSUPER．retro．neo中,构建针对NF—κB P65基因的shRNA表达载体。经293A细胞包装,并感染NIH3T3细胞进行病毒滴度测定后,感染THP-1细胞。分别采用RT—PCR和Western blot从mRNA和蛋白水平检测干扰效果。结果：限制性酶切和基因测序证实针对人NF-κB P65亚基的shRNA表达逆转录病毒载体成功构建;其感染THP-1细胞后,NF—κB P65的mRNA和蛋白表达明显抑制。结论：成功构建了NF-κB P65 shRNA逆转录病毒表达载体,该载体能高效感染THP-1并明显抑制NF—κB P65的表达。     

人IL-12重组逆转录病毒载体在HeLa细胞中的表达

目的:包装携带人白细胞介素12(IL-12)的逆转录病毒,用于宫颈癌的治疗研究.方法:携带IL-12的逆转录病毒重组质粒pL35P40SN经PA317细胞包装,G418筛选.在NIH3T3细胞进行病毒滴度测定.然后用病毒感染人宫颈癌细胞HeLa.PCR、RT-PCR方法检测IL-12基因在HeLa中的整合和表达情况.结果:重组质粒pL35P40SN经PA317细胞包装后收获病毒上清,感染HeLa细胞,检测发现IL-12基因整合到细胞基因组DNA中,并且能有效的转录.结论:成功包装了携带IL-12基因的逆转录病毒,该病毒能有效感染HeLa细胞,并使携带的基因IL-12在细胞中表达,为今后IL-12基因治疗宫颈癌的研究奠定基础.     

人sTNFR1基因的克隆以及在NIH3T3细胞中的稳定表达

以He1a细胞的总RNA为模板,用RT—PCR方法扩增sTNFR1全编码区基因片段,构建含有目的片段的T载体克隆及真核表达载体pcDNA3．1（-）重组质粒亚克隆,将重组质粒和脂质体共同转染NIH3T3细胞系,G418筛选稳定转染细胞株．经核苷酸序列测序和酶切鉴定,成功构建了pcDNA3．1（-）-sTNFR1真核表达质粒,脂质体法建立了高效表达sTNFRI的稳定转染细胞系,并经RT—PCR和Western Blotting鉴定．人sTNFR1基因能在NIH3T3细胞系中稳定表达,为今后的研究打下了基础．     

hEPO cDNA重组逆转录病毒的构建

通过DNA重组技术,将不含非编码区的hEPO cDNA片段重组到逆转录病毒质粒pLXSN, pLNCX中重组质粒转染PA317细胞后,经G418筛选,抗性克隆细胞培养上清能成功地感染NIH3T3细胞,使之在筛选培养基中形成典型的G418抗性克隆,该克隆细胞染色体中成功地整合了EPOcDNA,并且表达出有生物学活性的红细胞生成素(EPO)产物。     

抑制RAGE表达的siRNA重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建特异性针对细胞膜上晚期糖基化终末产物受体（RAGE）的小干扰RNA（siRNA）腺病毒载体,鉴定其对大鼠胰岛β细胞系INS-1细胞RAGE表达的影响。方法设计并合成针对大鼠RAGE基因的siRNA的靶DNA序列,克隆于穿梭载体pAdTrack中,与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在BJ5183细菌中进行同源重组,脂质体法转染至QB1293A细胞中包装,获得RAGE—siRNA的重组腺病毒,荧光显微镜观察RAGE—siRNA感染INS-1细胞后绿色荧光蛋白（GFP）的表达,Western印迹检测RAGE的蛋白表达。结果成功制备RAGE—siRNA重组腺病毒,在INS-1细胞中RAGE—siRNA感染效率达到90％以上,并能够抑制INS-1细胞RAGE的表达。结论成功构建了携带RAGE的siRNA重组腺病毒载体,能有效沉默INS-1细胞中RAGE的表达。     

A recombinant murine retrovirus for simian virus 40 large T cDNA transforms mouse fibroblasts to anchorage-independent growth.

A recombinant murine retrovirus containing the intact cDNA sequence for the simian virus 40 (SV40) large T antigen (T) was constructed by using the pZIPNeo SV(X)1 vector. Psi 2 packaging cells were then transfected, and G418-resistant clones were used to generate helper-free viral stocks. NIH 3T3 mouse fibroblasts infected by the recombinant T cDNA retrovirus were selected fro G418 resistance. Such cultures synthesized authentic SV40 T and were transformed to anchorage-independent growth at high efficiency. Therefore, this vector has allowed the study of the transformation properties of T under conditions of neutral drug selection and in the absence of SV40 small t antigen.     

丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶AKT2的体外激酶活性分析

目的 建立蛋白激酶AKT2体外磷酸化检测体系.方法 构建携带AKT2 cDNA编码区的pLNCX2逆转录病毒重组载体,包装重组病毒,转导293A细胞,G418筛选得到稳定表达组成型活化的AKT2细胞株,应用免疫沉淀获得蛋白激AKT2;将核基质结合蛋白SATB1的1～204的氨基酸序列及其47位丝氨酸的突变体S47A、S47D,分别与GST基因融合表达载体pGEX4T-1进行重组,经测序鉴定后转化大肠埃希菌BL-21,IPTG诱导表达经亲和纯化得到GST-SATB1 1-204、GST-SATB1 1-204 S47A和GST-SATB1 1-204 S47D融合蛋白;利用免疫沉淀的AKT2磷酸化GST-SATB1融合蛋白,应用免疫印迹检测其是否被磷酸化.结果 细胞表达的蛋白激酶AKT2能高效的将野生型SATB1 1-204 磷酸化,而不能磷酸化其两种突变体.结论 成功建立了一个蛋白激酶体外磷酸化系统.     

Expression of Recombinant Carcinoembryonic-Antigen-Human-β-Defensin-2 Gene in Colon Cancer HCT116 Cells

The objective of this study was to construct a system driving high expression of human-β-denfensin-2 (HBD-2) system in eukaryotic cell. To construct recombinant retrovirus expression vector, CEA signal peptide-HBD-2 (mature peptide sequence) was cloned in the retrovirus expression vector PLNCX2. The retroviral vector was transfected into PT67 cells by DOTAP; after screening and amplifying single clone cell by G418, the virus particles were collected and infected to eukaryotic, colon cancer HCT116 cells. Furthermore, the HCT116 cells were also screened by using G418 and the resistance clones were obtained. Finally, the expression of HBD-2 was detected by Western blotting, which suggested a high level of expression of HBD-2 in HCT116 cells. In conclusion, the results indicate that high level of HBD-2 expression was obtained in HCT116 cells which will help in effective commercial production and purification of HBD-2 protein.     

pcDNA3.1-Canstatin-3Flag真核表达载体的构建及转染HepG2细胞中的表达

目的:构建pcDNA3.1-Canstatin-3Flag载体并稳定转染肝癌HepG2细胞,检测canstatin在mRNA水平的表达。方法:胎盘中提取总RNA,RT-PCR法获得canstatinDNA,克隆至pcDNA3.1(-)载体中,并测序,重组质粒pcDNA3.1-Canstatin-3Flag转染肝癌HepG2细胞,G418筛选出稳定转染细胞,RT-PCR检测canstatin mRNA表达。结果:1.成功构建出pcDNA3.1-Canstatin-3Flag重组质粒;2.获得稳定转染pcDNA3.1-Canstatin-3Flag的肝癌HepG2细胞;3.发现转染后的肝癌HepG2细胞canstatin在mRNA水平比未转染细胞有明显的增强。结论:获得了稳定转染pcDNA3.1-Canstatin-3Flag的肝癌HepG2细胞,为后期canstatin在肝癌中的研究提供了支持。     

FLT3配基在人骨髓基质细胞系中的基因转移与表达

目的：研究逆转录病毒介导的FL在骨髓基质细胞系HFCL中的表达。方法：采用脂质体法将重组质粒pLF-SN/HFCL和空载体pLXSN/HFCL转染包装细胞PA317,G418筛选抗性克隆,用抗性克隆上清液感染HFCL。RT－PCR和基因组DNA－PCR检测外源基因mRNA水平的表达及染色体的整合,小鼠CFU－GM集落法检测FL生物学活性。结果：在mRNA水平上有FL的表达,染色体基因组中整合有标记neo基因和FL基因。活性测试结果显示转染的骨髓基质细胞分泌FL。结论：提示骨髓基质细胞可作为基因治疗的靶细胞。     

LMO3逆转录病毒表达载体的构建及其对SK-N-AS细胞增殖的影响

目的构建包含LM03（LIM-only3,LM03）全长基因的逆转录病毒表达载体,感染人神经母细胞瘤SK-N-AS,检测LM03对SK-N-AS细胞增殖的影响。方法将质粒pEGFP-Cl-一LM03经EcoRI和BamHI双酶切后亚克隆至逆转录病毒载体pLXSN,构建重组逆转录病毒表达载体pLXSN-LMO3,导人包装细胞pA317,获得逆转录病毒颗粒,感染SK-N-AS细胞,用RT-PCR及Western印迹鉴定,检测LM03感染后细胞的增殖及细胞周期分布情况。结果获得了能正确表达LM03基因的重组逆转录病毒表达载体pLX-SN-LMO3;LM03基因被逆转录病毒成功导入SK-N-AS细胞后,与对照组细胞相比,LM03感染组G1／G1期细胞减少,S期细胞增加,感染48h后,LM03感染组细胞的增殖能力显著高于空载体对照组及SK-N．AS组（P〈0．05）。结论成功构建了LM03基因的逆转录病毒表达载体,LMO3可以通过促进SK-N-AS细胞由G0／G1期进入S期,从而促进细胞的增殖。     

小鼠DLL1真核表达载体的构建及其在肿瘤细胞中的表达

目的：构建带绿色荧光蛋白的小鼠DLL1全长基因真核表达载体,并在肿瘤细胞中表达。方法：利用PCR特异性引物扩增出DLL1基因全长,将克隆的基因片段插入带绿色荧光蛋白的真核表达载体pIRES2-EGFP质粒中。然后利用脂质体将重组质粒pIRES2-EGFP-DLL1转染进小鼠B16黑色素瘤细胞中,并通过G418筛选后选取生长良好、荧光强度高的三株单克隆进行mRNA水平DLL1表达的鉴定。结果：成功扩增小鼠DLL1的全长基因。克隆入质粒载体后,通过DNA序列测定证实其序列正确。将构建的pIRES2-EGFP-DLL1质粒转染小鼠B16黑色素瘤细胞,经过G418筛选和荧光显微镜观察后,挑选得到GFP阳性率90%以上的稳定转染细胞株。RT-PCR检测稳定转染细胞的mDLL1的表达显著增加,进一步证实了pIRES2-EGFP-DLL1的表达效能。结论：成功构建了小鼠DLL1基因的真核表达质粒,证实其在真核细胞B16中可以表达。     

人ABCB6表达载体的构建及稳定表达细胞株A375的筛选

目的构建表达载体pIRES2-ZsGreen1-ABCB6,在转染的人黑素瘤细胞系株A375中筛选其稳定表达的细胞株。方法抽取健康人外周血,分离外周血单个核细胞,提取总RNA,逆转录获取cDNA序列,加入特异性引物经PCR扩增获得ABCB6cDNA双链,再经过BglII、EcoRI双酶切PCR产物及质粒载体pIRES2-ZsGreen1,酶切产物经回收、T4DNA连接酶连接,产物转化到大肠杆菌DH5α,挑取阳性克隆经菌落PCR鉴定、酶切鉴定和测序分析,以确定构建质粒正确。转染人黑素瘤细胞株A375,G418筛选稳定表达ABCB6的单克隆细胞株,应用荧光显微镜鉴定ABCB6蛋白的表达情况。结果 pIRES2-ZsGreen1-ABCB6质粒经菌落PCR、酶切、测序鉴定正确,经过G418筛选后获得稳定细胞株,在荧光显微镜下可观察到绿色荧光蛋白在A375细胞中的表达。结论表达载体pIRES2-ZsGreen1-ABCB6构建正确,并成功筛选出稳定表达ABCB6的A375细胞株,为进一步研究ABCB6的生物学功能奠定了良好基础。     

稳定表达黄嘌呤氧化还原酶的人类神经外胚层瘤PFSK细胞株的建立（简报）

Xanthine Oxidoreductase (XOR) is the key enzyme in purine metabolism and also produces oxygen free radicals. As a continuation of our previous work, in this study, we constructed a retrovirus expression vector (pLNCX2-XOR) containing full length of XOR cDNA. Retrovirus was produced by the virus package cell line PT-67 following the transfection of PT-67 with pLNCX2-XOR and used to infect the human primitive neuroectodermal tumor cell line (PFSK). Infected PFSK cells were selected by G418 to establish cell line with stable expression of XOR. The expression of XOR in the cell line we established was confirmed by RT-PCR, Immunocytochemistry and XOR activity assay.