抗人尿道高分化鳞癌单克隆抗体的研制

用本室建立的人尿道高分化鳞状上皮癌细胞株(Hus-98)免疫Balb/C小鼠,通过细胞杂交技术及ELISA方法进行筛选,SP免疫组织化学方法进行鉴定,获得10株能稳定分泌、选择性强、效价高的杂交瘤细胞株;同时从乳腺癌组织中提出肿瘤相关抗原行免疫印记实验(Western-blot)。结果6株经4次克隆能稳定分泌抗体Ig,免疫组化显示这些抗体是针对来源于上皮的鳞癌、腺癌细胞膜和细胞浆的,而癌旁正常组织及胎儿组织呈阴性反应;通过western-blot结果显示肿瘤相关抗原分子量为46.414kb。     

肺腺癌组织中表皮生长因子受体基因突变的检测及其临床意义

目的:通过检测肺腺癌组织中表皮生长因子受体(EGFR)基因的突变情况,研究EGFR突变与患者临床特征(性别、年龄和吸烟史)的相关性。方法:收集160例肺腺癌患者术前的石蜡组织标本,提取DNA后用实时定量PCR方法对EGFR基因18~21外显子进行突变检测;对基因突变结果与患者的性别、年龄和吸烟史分别做χ2检验。结果:160例肺腺癌组织标本中,有57例检测到EGFR基因突变,突变率为35.6%,且突变与患者性别、年龄和吸烟史均无显著相关性(P0.05);57例EGFR基因突变标本中,27例为19外显子缺失,22例为21外显子L858R点突变,这2种突变占总突变类型的85.96%,并且与患者性别、年龄及吸烟史无显著相关性(P0.05)。结论:EGFR基因在女性不吸烟肺腺癌中有较高的突变率,突变主要集中在19外显子缺失和21外显子L858R点突变,但突变率及突变类型与患者性别、年龄和吸烟史均不相关。     

疱疹病毒Ⅱ型感染SH-SY5Y细胞的生物学效应

目的：探讨疱疹病毒Ⅱ型（HSV-2）感染人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y的生物学效应。方法：病毒液接种SH-SY5Y细胞后,用相差和电子显微镜观察感染细胞的形态变化,RT-PCR检测病毒在细胞中的增殖,MTT法检测病毒感染对细胞增殖的影响,流式细胞仪测定感染后的细胞凋亡状况。结果：相差显微镜显示细胞病变,从24～72h,细胞变性、坏死的程度和数量随感染时间延长而增加;电镜结果显示感染24h后,细胞核染色质固缩,出现多核巨细胞,线粒体内嵴紊乱、断裂,出现不同程度的自噬化、溶酶体化、空泡化,并可见大量鹰眼样已包装成熟的病毒颗粒及正在包装的病毒粒子;HSV-2LAT基因RT-PCR扩增表明,病毒能在SH-SY5Y细胞中增殖;凋亡检测显示HSV-2在体外细胞感染中并未使细胞出现凋亡现象;感染后24、48及72h,SH-SY5Y细胞的抑制率分别为11.3%、31.2%和63.1%,与对照组相比均存在显著性差异（P〈0.05）;分别用0.1、1、10MOI的病毒感染SH-SY5Y细胞,上述不同组在24、48、72h时细胞形态变化基本一致,感染结果相似,各组之间病毒毒力无明显差异（P〉0.05）。结论：初步在人神经母细胞瘤细胞株SH—SY5Y中建立了HSV-2感染的细胞模型,并研究了感染对细胞生物性状的影响,为探讨HSV-2的潜伏与激发机制、了解HSV-2的致病机制打下基础。     

整合素αvβ3对MDA-MB-231BO乳腺癌细胞AKT信号通路的调控

旨在探究整合素αvβ3的单克隆抗体LM609在BSP不同表达水平的乳腺癌细胞中对AKT(蛋白激酶B)信号通路的影响。利用免疫细胞化学法检测BSP不同表达水平的乳腺癌细胞中整合素αvβ3的表达量。BSP基因沉默乳腺癌MDA-MB-231BO细胞,Western blotting在蛋白水平检测磷酸化AKT的表达,MTT试验和细胞划痕试验分别检测细胞增殖、迁移能力的变化。结果显示,与231BO-Scrambled细胞相比,231BO-BSP27细胞中BSP蛋白水平明显降低,抑制率达到(59.43±1.71)%;LM609分别处理两株细胞后,与对照组231BO-Scrambled细胞相比,BSP基因沉默组21BO-BSP27细胞中AKT磷酸化水平下调明显,为(33.78±1.51)%(P<0.01);231BO-BSP27细胞和对照组231BO-Scrambled中细胞的增殖和迁移能力均有不同程度的下降(P<0.05)。LM609能够抑制胞内整合素αvβ3功能的表达,进而对AKT信号通路进行调控,并影响细胞增殖和迁移的发生。     

人ING4的基因克隆及真核表达

目的克隆人生长抑制因子家族（inhibitor of growth famility member4,ING4）基因,构建其真核表达载体pEGFP—ING4。方法提取人胎盘总RNA,经RT—PCR扩增出ING4 cDNA,克隆至pEGFP—C2载体,构建的真核表达载体pEGFP—ING4用双酶切、基因测序进行序列鉴定;转染MCF-7细胞用荧光显微镜和免疫组化检测重组质粒的表达。结果RT—PCR产物为750bp的条带,双酶切和基因测序正确,转染可见目的蛋白融合表达。结论从人胎盘组织中成功克隆了ING4基因并构建其真核表达质粒在人MCF-7细胞中表达,为进一步研究1NG4基因的作用及抗肿瘤机制奠定了基础。     

单纯疱疹病毒Ⅱ型潜伏、激活细胞模型建立

【目的】建立单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2)潜伏感染人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y及激活的细胞模型。【方法】分别加入20,40,60,80,100,120,140μmol/L的阿昔洛韦(ACV),观察对SH-SY5Y细胞生物性状的影响;在ACV存在的情况下,分别将含有0.1、1、10、100MOI的病毒液接种SH-SY5Y细胞,运用相差显微镜观察病毒对细胞的影响,确定潜伏的建立;分别用41℃、42℃、43℃、44℃、45℃加热0.5h、1.0h、1.5h、2.0h、2.5h,观察加热时间及温度诱导HSV-2在SH-SY5Y细胞中激发的最适条件;加入25、50、75、100、125μmol/L福斯高林(Forskolin)诱导病毒在细胞中激活,探讨诱导的最佳浓度;对HSV-2在SH-SY5Y细胞中的潜伏及激发进行验证并测序;运用相差显微镜观察病毒激活后细胞形态的变化。【结果】60μmol/LACV的存在最适合HSV-2在SH-SY5Y细胞中建立潜伏状态;1-10MOI的感染量均能取得较好的病毒潜伏及激发效果;通过观察,病毒在SH-SY5Y细胞中最长可潜伏14d;43℃,1.5h及75μmol/LForskolin均为诱导病毒潜伏激发的最佳条件;相差显微镜观察病毒激发后细胞病变,从24h到72h,细胞变性、坏死的程度、数量随感染时间延长而增加;HSV-2LAT、gG基因PCR扩增及电泳结果,证实病毒在细胞中的潜伏及激活。【结论】初步在人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y上建立了HSV-2潜伏感染及激活的细胞模型,为下一步研究HSV-2的潜伏与激发机理,了解HSV-2的致病机制打下基础。     

新型DNA疫苗的构建及其对小鼠保护作用的研究

目的：构建新型单纯疱疹病毒Ⅱ型DNA疫苗,检测其激发小鼠产生免疫反应的能力。方法：RT-PCR鉴定单纯疱疹病毒Ⅱ型DNA疫苗在COS-7细胞中的表达,ELISA检测血清中中和抗体水平,病毒攻击检测其保护效应。结果：DNA疫苗候选株pVAX-gD能在COS-7细胞中表达,激发小鼠产生高滴度中和抗体,有效保护小鼠免受致死量病毒的攻击。结论：构建的新型单纯疱疹DNA疫苗是一株很有希望的人用生殖器疱疹疫苗。     

GFP为报告基因的酵母哺乳动物细胞穿梭载体的构建及其在人血管内皮细胞中的表达

为研究酵母作为载体在口服基因治疗及免疫中的作用 ,需要一种能够在酵母中复制而在哺乳动物细胞中表达的穿梭载体 .利用通用载体质粒融合系统 (UPS)构建了一种以GFP为报告基因的新载体 ,以常规的氯化锂法对酿酒酵母进行转化 ,证明该载体能够在酵母中复制 ;以脂质体介导向人血管内皮细胞进行了转染 ,有绿色荧光 ,证明该载体能够在哺乳动物细胞中表达 .所获得的新型的穿梭载体为口服酵母在基因治疗中的应用提供了物质准备     

BSP基因RNA干扰对乳腺癌MDA-MB-231BO细胞生物学特性的影响

旨在研究RNA干扰(RNA interference,RNAi)抑制骨唾液酸蛋白(bone sialoprotein,BSP)基因表达后对人乳腺癌细胞MDA-MB-231BO生物学特性的影响。应用pSilencer5.1-U6Retro构建针对BSP基因的siRNA逆转录病毒重组表达质粒,将重组质粒转染293细胞制备病毒悬液感染MDA-MB-231BO细胞,利用嘌呤霉素筛选抑制BSP表达的乳腺癌细胞。Western blotting检测细胞内BSP蛋白表达,采用MTT法和集落形成试验检测细胞的增殖,流式细胞仪检测细胞周期变化。结果显示,成功构建BSP基因RNAi稳定转染的231BO-BSP27细胞。231BO-BSP27细胞内BSP蛋白表达抑制率为69.3%,与对照组细胞相比,231BO-BSP27细胞的生长速率和克隆形成率明显降低;S期细胞数量明显减少,G0/G1期细胞增多。由此证实,逆转录病毒介导的RNAi能实现BSP基因稳定沉默,从而抑制MDA-MB-231BO细胞的生长和增殖。     

人尿道(阴茎)鳞癌上皮细胞(HUS-98)cDNA文库的构建及鉴定

为了进一步分离人尿道(阴茎)鳞癌组织特异性表达基因和鳞癌特异性相关基因,采用SMART技术,构建了人尿道 (阴茎)鳞癌上皮细胞cDNA文库,从人尿道(阴茎)鳞癌上皮细胞中分离总RNA并纯化mRNA,利用经修饰的oligo(dT)引物 合成cDNA第一链,利用SMART核苷酸作为cDNA第一链在mRNA5′端延伸出去的模板,采用LD-PCR合成双链cDNA,双链 cDNA经酶切和过柱分级分离后,克隆入λTriplEx2载体后经体外包装而成cDNA文库。结果表明原始人尿道(阴茎)鳞癌上 皮cDNA文库获得1.57×107个重组子,重组率达到98%。文库扩增后,滴度达到4.0×109pfu/ml,插入cDNA平均长度为2.5kb。 构建的人尿道(阴茎)鳞癌上皮cDNA文库具有良好的质量,该cDNA文库为进一步筛选鳞癌抑癌基因及鳞癌特异性表达基因 奠定了基础。