基础生物化学实验教学对学生技能的培养

面对国内实验教学的新形势和新要求,改进和完善本科实验教学日益紧迫。介绍了本科基础生物化学实验教学的内容与实践,根据生化实验课的特点,对实验教学内容、方式等进行改进,强调了以基本技术围绕基本实验与综合性实验为中心,培养学生的实践能力、创新能力与科学思维,重点强化了实验技能与素质的训练,探索了生化实验教学中培养高素质、综合型创新人才之路。     

冻干加热处理凝血因子类制剂的病毒灭活验证

在病毒灭活验证过程中,比较了冻干后不同加热方法对凝血因子类制剂中伪狂犬病毒(PRV)的灭活效果,包括80℃干烤72h、100℃水浴加热30min以及100℃蒸汽加热30min方法。结果表明80℃干烤72h对制品中PRV灭活较彻底,另外两种方法对制品中PRV的灭活效果均不理想。     

均匀设计法优化烟管菌产漆酶培养基

应用均匀设计、二次多项式逐步回归分析对烟管菌(Bjerkandera adusta)WZFF.W-Y11产漆酶液态发酵培养基进行优化。结果表明,培养基组成为麸皮水解液1%、淀粉24.0 g/L、葡萄糖24.0 g/L、豆饼粉4.8 g/L、NH₄Cl 3.2g/L、KH₂PO₄ 3.2 g/L、MgSO₄·7H₂O 0.2 g/L、CuSO₄ ·5H₂O 0.006 g/L,起始pH6.5,在28℃、150r/min、250mL的摇瓶培养条件下可以稳定地获得9672U/L的漆酶活力。     

S／D法处理凝血因子浓缩物类制品的病毒灭活验证

以水泡性口炎病毒 (VSV)为指示病毒 ,验证应用有机溶剂 /去污剂 (简称S/D)法灭活血液制品中病毒的生产工艺 ,并对不同厂家不同批号的四种凝血因子浓缩物类制品 (中间品 )的病毒灭活效果进行了分析总结。结果表明当制品中TNBP和Tween80终浓度为 0 3%和 1 0 % ,在 2 5± 1℃处理 6小时后对于包膜病毒确有显著的灭活效果。     

小鼠巨核系祖细胞增殖,分化特性的研究

小鼠骨髓细胞经7d培养后进行细胞形态学观察,可见不同发育阶段的巨核细胞及不同大小的巨核细胞集落。通过计数每个集落中的细胞数,可确定相应祖细胞的有丝分裂能力。结果表明,具有不同有丝分裂能力的祖细胞的体外增殖动力学有所不同。祖细胞的数量与其有丝分裂次数呈负相关(r=-0.986)。进行0、1、2和3次有丝分裂的祖细胞的阿糖胞苷自杀率分别为48.9,58.7,48.0和41.2％;放射敏感性的D_O值(Gy)分别为1.71,1.24,1.03和0.77,D_O值的大小与有丝分裂次数呈负相关(r=-0.958)。经3Gy全身照射后CFU-Meg与CFU-GM的恢复动态过程具有不同特点。     

LMO3逆转录病毒表达载体的构建及其对SK-N-AS细胞增殖的影响

目的构建包含LM03（LIM-only3,LM03）全长基因的逆转录病毒表达载体,感染人神经母细胞瘤SK-N-AS,检测LM03对SK-N-AS细胞增殖的影响。方法将质粒pEGFP-Cl-一LM03经EcoRI和BamHI双酶切后亚克隆至逆转录病毒载体pLXSN,构建重组逆转录病毒表达载体pLXSN-LMO3,导人包装细胞pA317,获得逆转录病毒颗粒,感染SK-N-AS细胞,用RT-PCR及Western印迹鉴定,检测LM03感染后细胞的增殖及细胞周期分布情况。结果获得了能正确表达LM03基因的重组逆转录病毒表达载体pLX-SN-LMO3;LM03基因被逆转录病毒成功导入SK-N-AS细胞后,与对照组细胞相比,LM03感染组G1／G1期细胞减少,S期细胞增加,感染48h后,LM03感染组细胞的增殖能力显著高于空载体对照组及SK-N．AS组（P〈0．05）。结论成功构建了LM03基因的逆转录病毒表达载体,LMO3可以通过促进SK-N-AS细胞由G0／G1期进入S期,从而促进细胞的增殖。     

S/D法灭活血液制剂中脂包膜病毒效果验证的研究

选用不同核酸的脂包膜病毒,其中RNA病毒为水疱性口炎病毒(VSV),DNA病毒为伪狂犬病毒(PRV),将两种指示病毒分别用于验证S/D法处理对纤维蛋白原、凝血酶原复合物、凝血因子Ⅷ、静注丙种球蛋白、免疫血浆等血液制剂的病毒灭活效果。结果该法对所有被处理的血液制剂中的PRV及VSV灭活能力分别为≥3.38~5.88和≥3.50~4.75logTCID50/0.1ml,表明S/D法对两种病毒核酸类型的脂包膜病毒有良好的灭活效果。     

黑曲霉水解京尼平苷β-葡萄糖苷酶的分离纯化及其酶学性质

黑曲霉Aspergillus niger发酵豆渣产β-葡萄糖苷酶(BGL)。粗酶液依次经过乙醇沉淀和DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析,获得了两种电泳纯的β-葡萄糖苷酶BGL1和BGL2,它们的相对分子质量分别为102kDa、97kDa,总酶活回收率达到48%。在pH2.5及温度为55℃时,两种BGL水解京尼平苷的速度均达到最大;BGL水解活性受到Na+的激活但不受K+的影响,但Mg2+、Ba2+、Cu2+、Fe2+、Zn2+和Hg+等离子对BGL活性有不同程度的抑制作用(其中对BGL1的抑制普遍强于BGL2),而且同一种离子对不同BGL活性的影响性质不同,Ca2+显著激活BGL1而对BGL2无影响,Fe3+显著抑制BGL1而激活BGL2。在同样条件下,BGL对对硝基苯-β-D吡喃葡萄糖苷(pNPGlu)、对硝基苯-β-D吡喃半乳糖苷(pNPGal)和水杨苷均有催化活性,其中对pNPGlu的Km值最小,BGL1、BGL2分别为0.764和1.934mmol/L;而BGL对京尼平苷水解的催化效率最高,BGL1、BGL2的Kcat/Km值分别为4.28×104和1.04×105L/mol·s。BGL1、BGL2活性的pH稳定范围相近,分别为pH2.0-7.0、pH2.0-8.5,但它们的热稳定性差异较大,55℃时BGL2保温60min,酶活保留了60%,而BGL1的酶活半衰期只有10min。     

煤附生真菌产漆酶菌株的分离鉴定及产酶特性研究

从煤炭样品中筛选到一株产漆酶活性菌株,经菌体形态观察和ITS序列分析,鉴定为Trichoderma asperellum W03。菌株所产漆酶的最适反应pH为3.5-4.5,最适反应温度45℃,类似于白腐真菌漆酶。液态发酵条件的均匀设计实验表明,适宜的发酵培养基组成为:土豆200.00g/L、葡萄糖9.36g/L、米糠粉37.44g/L、硝酸钾4.00g/L、KH2PO43.20g/L、MgSO4·7H2O2.00g/L、CuSO4·5H2O0.005g/L、初始pH8.0;在33℃、180r/min、50mL/250mL的摇瓶培养条件下,棘孢木霉W03在孢子接种培养后48h、84h产酶量较高,分别处在菌体的快速生长期和衰亡期;菌体产酶受Cu2+、联苯胺诱导,而受1-萘酚、愈创木酚和2,4-D抑制。     

液态生产胞外漆酶大型真菌高产菌株筛选

依照真菌漆酶催化特定作用底物进行氧化还原反应结果的特性,设计了一个采用愈创木酚和α-萘酚作为酶反应显色判别依据和产酶菌株筛选的限制性驯化剂,同时结合选用木质素作为产酶诱导强化因子的筛选分析模版,对保藏和外购的常见大型担子菌和食用真菌进行产酶性能分析。结果发现,这些菌株均不能有效地生产漆酶或酶活性很低,以该模版作为初筛手段从杨树林等野生菌菇生长地中分离得到15株产酶野生微生物,经反复筛选得到3株酶活性较高的大型真菌株A21、X18和Y11,其胞外漆酶活力分别为255.9、248.7 和277.3 U·ml^-1,具有可观的产业化生产开发应用潜力。