一种改良的逼尿肌急性分离方法及离子通道电流检测

目的:建立一种稳定的适合膜片钳技术的逼尿肌细胞急性酶分离方法,为排尿相关障碍性疾病的研究提供必要的技术平台.方法:采用H型胶原酶和木瓜蛋白酶相混合的鸡尾酒酶液对新鲜离体的大鼠膀胱逼尿肌条在37℃条件下振荡消化,α-actin免疫荧光染色对分离并培养的原代细胞进行鉴定,在膜片钳工作台上分别对其进行L型钙电流和BKca钾电流的全细胞记录.结果:可获得大量的单个逼尿肌细胞.经过免疫荧光染色证实为平滑肌细胞.分离细胞活性良好,在膜片钳实验系统上可记录到多种通道电流.结论:建立了一种操作简单、成功率高、活性好的逼尿肌细胞急性酶分离方法并成功应用于膜片钳技术.     

从七肽噬菌体展示库中筛选内毒素结合蛋白质配基

目的:研究从噬茵体展示库中筛选内毒素结合蛋白质配基,为其在内毒素致病作用机理及在内毒素血症防治研究中的应用奠定基础.方法:以内毒素为靶分子从随机七肽噬菌体展示库中筛选内毒素的高亲和力噬菌体配体,通过ELISA鉴定,DNA测序及相关软件分析.结果:所筛选的亲和力最高的噬菌体的ELISA检测值A405nm可达1.965通过比较亲和性噬菌体外源插入肽的DNA序列,认为FHENWPS肽段中包含有与内毒素分子发生亲和结合的一个共有序列.该序列展示肽的等电点为5.36,具有双嗜性,这有利于肽与LPS分子表面的位点相互作用从而产生亲和吸附.结论:运用亲和筛选方法从肽库中筛选内毒素结合蛋白质配基是可行的.     

免疫磁珠分选人角朊干细胞的实验研究

目的:探索人角朊干细胞(keratinocyte stem cells,KSCs)的免疫磁珠分选(Magnetic Activated Cell Sorting,MACS)的方法。方法:从人包皮组织获得角朊细胞悬液,然后利用人角朊干细胞表面CD49f(整合素α6)和CD71的表达情况(CD49fbriCD71dim)通过MACS法将KSCs分选出来,在荧光显微镜下观察其荧光标记情况,同时将分选所得的CD49fbriCD71dim细胞进行体外无血清培养,观察其形态及克隆形成。结果:人角朊细胞经MACS法分选后所得的CD49fbriCD71dim细胞比率可达12．02(±6．92)%。CD49fbriCD71dim细胞经培养可见细胞为典型的上皮样特征,呈铺路石样形态,高核浆比例,细胞紧密排列,轮廓清楚,折光性好,并可在5-7天左右形成全克隆,符合KSCs的特点。结论:研究表明MACS分选法可以得到较高比例的人角朊干细胞,并能进行后续培养研究,其不失为一种较理想的人角朊干细胞的分选方法。     

128例闭合性腹部损伤合并颅脑损伤患者的临床救治分析

目的:回顾总结闭合性腹部损伤合并颅脑损伤患者的诊治体会,为严重创伤患者的救治提供理论依据.方法:选取128例闭合性腹部损伤合并颅脑损伤的患者为研究对象,对其诊疗情况进行分析.结果:128例中治愈117例,死亡11例.结论:闭合性腹部损伤合并颅脑损伤患者的损伤机制复杂.重视院前急救,重视合并其他部位的多发伤,及时准确判断生命体征,尽快采取有效生命支持,及时手术,是救治成功的关键.     

T型钙通道在逼尿肌过度活动发病中作用的实验研究

目的:研究T型钙通道在逼尿肌过度活动(detrusor overactivity,DO)大鼠模型中的改变并探索其在发病机制中的作用.方法:部分结扎雌性大鼠近端尿道制作DO动物模型,假手术组作为对照;6周后使用尿流动力学技术膀胱测压筛选实验动物;应用钙荧光探针Fluo-4比较模型和对照大鼠培养逼尿肌静息钙浓度,观察比较加入T型钙通道阻断剂Mibefradil后细胞静息钙浓度的变化;利用穿孔膜片钳技术比较模型和对照组大鼠急性分离逼尿肌细胞中T型钙通道密度.结果:膀胱测压中出现非排尿收缩的为DO大鼠.结果表明近端尿道部分结扎可成功制作DO动物模型;钙探针激光共聚焦实验表明当T型钙通道被抑制后,DO、对照逼尿肌细胞的静息钙荧光强度均显著下降,其中自身前后荧光变化率DO组显著大于正常组;穿孔膜片钳结果表明DO大鼠逼尿肌中T型钙通道的密度显著大于对照.结论:T型钙通道活动在DO动物中显著上调,这可能是导致该疾病的重要分子机制.     

Sox9基因诱导脂肪干细胞向软骨细胞分化

目的:观察Sox9基因对人脂肪干细胞(ADSCs)的诱导作用.方法:分离、纯化、培养人源ADSCs,并绘制生长曲线,传代三次后的ADSCs利用脂质体转染Sox9基因,选用抗生素G418进行筛选.以空载体转染细胞作对照,分别取48h和14d转染后的细胞做Flag蛋白免疫组织化学鉴定.通过检测转染细胞中Ⅱ型胶原来确定ADSCs是否向软骨细胞分化.结果:ADSCs呈长梭形,形态与骨髓间充质干细胞相似,600μ/ml G418为最适筛选浓度.转染后第48h和14d的细胞均能表达Sox9基因融合表达的Flag蛋白.第48h和14d,转染效率分别为93%和75%.转染后14d的ADSCs表达Ⅱ型胶原,转染后48h实验组和对照组都为阴性.结论:Sox9基因能诱导脂肪干细胞向软骨细胞分化.     

白藜芦醇联合乌司他丁治疗急性胰腺炎的疗效分析

目的：观察白藜芦醇联合乌司他丁对大鼠急性胰腺炎（AP）的治疗效果。方法：将250只雄性Wister大鼠随机分为5组,分别为假手术（A）组、急性胰腺炎组（B组）、白藜芦醇组（C组）、乌司他丁组（D组）和白藜芦醇联合乌司他丁治疗组（C＋D组）。制备各组AS大鼠模型,观察各组腹水量及血淀粉酶、脂肪酶、TNF-α、NF—κB、丙二醛（MDA）及超氧化物歧化酶（SOD）水平,并观察胰腺病理改变。结果：B组与A组相比,SOD水平明显降低（P〈0．05）,MDA水平明显升高（P〈0．05）;C、D及C＋D组与B组相比,血清SOD水平明显升高（P〈0．05）,MDA水平明显降低（P〈0．05）;C＋D组与C组、D组相比,血清SOD水平明显升高（P〈O．05）,血清MDA水平明显降低（P〈0．05）。与B组比较,C和D组血淀粉酶、脂肪酶、TNF-α、病理学评分均降低,细胞超微结构损伤减轻,有显著性差异（P〈0．05或P〈0．01）。C＋D组上述指标改善较C组和D组更明显,差异有显著性（P〈0．05）。结论：乌司他丁、白藜芦醇通过升高SOD保护性因子、降低MDA损伤性因子,对急性胰腺炎有治疗作用,尤其在乌司他丁与白藜芦醇合用时效果更显著。     

人永生化角朊细胞表达干细胞表型的流式细胞术分析

观察人永生化角朊细胞系HaCaT细胞表达的几种干细胞表型,为以该细胞系构建人组织工程皮肤和进行基因操作提供相应的实验依据。方法:采用无血清培养基对HaCaT细胞进行培养,获取处于对数生长期的细胞进行直接荧光双标法、直接荧光单标法和间接荧光单标法以分别CD49fCD71、角蛋白K19、CD29和CD133,依托流式细胞仪检测上述抗原在HaCaT细胞的表达情况。结果:特异性较高的角朊干细胞表型CD49f D71-和K19 在HacaT细胞的百分率分别为16．6±2．8%和14．94±1．23%。CD29 HaCaT细胞为49．55±6．68%,可能包括了角朊干细胞和短暂扩增细胞。分别反映细胞黏附特性和增殖能力的CD49f HaCaT细胞和CD71 HaCaT细胞各占98．1±0．8%和82．1±3．9%。HaCaT细胞仅表达3．43±0．77%的干细胞表型CD133。结论:人永生化角朊细胞系HaCaT细胞的表型特征表明它具有较高的角朊干细胞和短暂扩增细胞比例以及很强的黏附基底膜特性和增殖能力,提示它可以作为构建人组织工程皮肤种子细胞和基因修饰角朊干细胞的替代物。