人CCL20基因打靶载体的构建与鉴定

目的:构建针对人CC亚族趋化因子配体20(CC chemokine ligand 20,CCL20)基因外显子2的置换型打靶栽体.方法:设计和合成引物,利用长距离聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)从永生化人角质形成细胞系(HaCaT)基因组DNA中克隆出CCL20基因组DNA片段,再以CCL20基因为模板扩增出长度为1969 bp的同源短臂和2356 bp的同源长臂.分别插入pioxP栽体的Neo基因上游和下游,构建针对人CCL20基因外显子2的置换型打靶载体(ploxP-hCCL20).将打靶载体线性化并以电穿孔方法转移入HaCaT,观察克隆的形成.结果:经过PCR、限制性内切酶鉴定及DNA序列测定.证实该载体的两条同源臂包含人CCL20基因的外显子1、3、4及其邻近的部分内含子.结论:ploxP-hCCL20载体构建成功,增加Neo基因下游同源臂长度的策略有可能提高细胞基因敲除的同源重组率.     

不同土壤水分条件下CO2浓度对禾谷缢管蚜种群的影响

利用开顶式熏气室研究了不同土壤水分条件下不同CO2浓度对禾谷缢管蚜种群的影响,以期对未来大气CO2浓度升高条件下不同降雨地区的小麦－蚜虫关系发展趋势做出蚜虫关系发展趋势做出初步预测,结果表明,随CO2浓度从350ul.L^-1上升至550ul.L^-1时,60％土壤水分下的种群增长最快;当CO2浓度从550ul.L^-1上升到700ul.L^-1时,60％和40％土亍水分下的种群增长相近,且高于80％土壤水分下的增长,据此可以认为,随大气CO2浓度升高,禾谷缢管蚜种群会持续增长,从目前至下世纪中叶的时间内可能是蚜种群增长最快的阶段,特别在干旱,半干旱地区禾谷缢管蚜种群增长幅度较大,小麦受受较重。     

不同土壤水分条件下CO_2浓度对禾谷缢管蚜种群的影响

利用开顶式熏气室研究了不同土壤水分条件下不同CO2 浓度对禾谷缢管蚜种群的影响 ,以期对未来大气CO2 浓度升高条件下不同降雨地区的小麦 蚜虫关系发展趋势做出初步预测 .结果表明 ,随CO2 浓度升高 ,禾谷缢管蚜种群持续增长 ,但以CO2 浓度从 35 0 μl·L-1上升到 5 5 0 μl·L-1时增长最快 ;禾谷缢管蚜种群大小与土壤水分密切相关 ,各CO2 浓度下均以 6 0 %土壤水分的最大 ;当CO2 浓度从 35 0 μl·L-1上升到 5 5 0 μl·L-1时 ,6 0 %土壤水分下的种群增长最快 ;当CO2 浓度从 5 5 0 μl·L-1上升到 70 0 μl·L-1时 ,6 0 %和 40 %土壤水分下的种群增长相近 ,且高于 80 %土壤水分下的增长 .据此可以认为 ,随大气CO2 浓度升高 ,禾谷缢管蚜种群会持续增长 ,从目前至下世纪中叶的时间内可能是蚜虫种群增长最快的阶段 ,特别在干旱、半干旱地区禾谷缢管蚜种群增长幅度较大、小麦受害较重 .     

HCV核心抗原基因的克隆和表达

用ＰＣＲ方法扩增人丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）Ｃ抗原部分基因片段,将其克隆到一种新的表达载体ＰＱＥ中构成重组质粒ＰＱＥ－Ｃｏｒｅ短,转化大肠杆菌Ｍ１５株。含ＰＱＥ－Ｃｏｒｅ重组质粒的工程菌株以２ＹＴ中３７℃下培养加入ＩＰＴＧ诱导７小时,经１５％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ凝胶电泳分离蛋白质,证明工程菌合成了大量改造的ＨＣＶ Ｃｏｒｅｎｈｊ ｒ     

免疫磁珠分选人角朊干细胞的实验研究

目的:探索人角朊干细胞(keratinocyte stem cells,KSCs)的免疫磁珠分选(Magnetic Activated Cell Sorting,MACS)的方法。方法:从人包皮组织获得角朊细胞悬液,然后利用人角朊干细胞表面CD49f(整合素α6)和CD71的表达情况(CD49fbriCD71dim)通过MACS法将KSCs分选出来,在荧光显微镜下观察其荧光标记情况,同时将分选所得的CD49fbriCD71dim细胞进行体外无血清培养,观察其形态及克隆形成。结果:人角朊细胞经MACS法分选后所得的CD49fbriCD71dim细胞比率可达12．02(±6．92)%。CD49fbriCD71dim细胞经培养可见细胞为典型的上皮样特征,呈铺路石样形态,高核浆比例,细胞紧密排列,轮廓清楚,折光性好,并可在5-7天左右形成全克隆,符合KSCs的特点。结论:研究表明MACS分选法可以得到较高比例的人角朊干细胞,并能进行后续培养研究,其不失为一种较理想的人角朊干细胞的分选方法。     

汉防己甲素滴眼液对高眼压模型大鼠的降眼压作用

目的比较观察汉防己甲素滴眼液与0.5%噻吗心安滴眼液对高眼压模型大鼠及正常大鼠降眼压的作用。方法正常SD大鼠共分4组：不同浓度的汉防己甲素滴眼液组（0.1%、0.2%、0.3%）及阳性对照组0.5%噻吗心安,药物滴右眼各一滴,阴性对照组生理盐水滴左眼、测量滴药前24h和滴药后1、3、6、24、48、72h的眼压。应用倍频532激光对SD大鼠右眼上巩膜静脉以及小梁网所在区域实施光凝术建立高眼压大鼠模型。高眼压模型鼠共分5组：不同浓度的汉防己甲素滴眼液0.05%、0.1%、0.2%、0.3%及阳性对照组0.5%噻吗心安,右眼即模型眼滴用药物,左眼作为空白对照。测量术前后的眼压。结果汉防己甲素滴眼液对大鼠正常眼压无降压作用（P〉0.05）。对高眼压大鼠用药后24h、72h、1周后,0.3%汉防己甲素滴眼液组降低眼压的幅度与0.5%噻吗心安滴眼液降低眼压的幅度相似（P〉0.05）;0.05%、0.1%、0.2%汉防己甲素滴眼液组也有明显的降压作用,但与0.5%噻吗心安滴眼液相比,降压幅度低于后者（P〈0.05）。结论0.05%、0.1%、0.2%、0.3%汉防己甲素滴眼液均有降低大鼠高眼压的作用,其中0.3%浓度的汉防己甲素滴眼液降眼压效果与0.5%的噻吗心安类似。汉防已甲素滴眼液作为一种治疗青光眼的药物有着良好应用前景。     

红花黄色素B对冈田酸致SH-SY5Y神经元损伤的保护作用

本研究目的是考察红花黄色素B(SYB)对冈田酸(OA)致SH-SY5Y神经元损伤的保护作用。采用全反式维甲酸(ATRA)诱导SH-SY5Y细胞分化为成熟神经元,OA诱导神经元损伤,建立Tau蛋白过度磷酸化的神经元突触萎缩模型;Giemsa染色法观察SH-SY5Y细胞形态学变化;Western Blot检测Tau蛋白262位点磷酸化水平;流式细胞术检测细胞总活性氧(ROS)和线粒体源ROS水平,以及线粒体膜电位的变化。结果表明,ATRA可诱导SH-SY5Y细胞分化为成熟神经元;OA可致神经元突触萎缩和Tau蛋白在262位点过度磷酸化;SYB能够改善OA所致成熟神经元损伤,降低Tau蛋白在262位点的磷酸化水平,其保护作用机制可能与减少胞内及线粒体源ROS产生,提高线粒体膜电位有关。     

人永生化角朊细胞表达干细胞表型的流式细胞术分析

观察人永生化角朊细胞系HaCaT细胞表达的几种干细胞表型,为以该细胞系构建人组织工程皮肤和进行基因操作提供相应的实验依据。方法:采用无血清培养基对HaCaT细胞进行培养,获取处于对数生长期的细胞进行直接荧光双标法、直接荧光单标法和间接荧光单标法以分别CD49fCD71、角蛋白K19、CD29和CD133,依托流式细胞仪检测上述抗原在HaCaT细胞的表达情况。结果:特异性较高的角朊干细胞表型CD49f D71-和K19 在HacaT细胞的百分率分别为16．6±2．8%和14．94±1．23%。CD29 HaCaT细胞为49．55±6．68%,可能包括了角朊干细胞和短暂扩增细胞。分别反映细胞黏附特性和增殖能力的CD49f HaCaT细胞和CD71 HaCaT细胞各占98．1±0．8%和82．1±3．9%。HaCaT细胞仅表达3．43±0．77%的干细胞表型CD133。结论:人永生化角朊细胞系HaCaT细胞的表型特征表明它具有较高的角朊干细胞和短暂扩增细胞比例以及很强的黏附基底膜特性和增殖能力,提示它可以作为构建人组织工程皮肤种子细胞和基因修饰角朊干细胞的替代物。     

亚胺培南对铜绿假单胞菌敏感和耐药菌株DNA释放的影响

目的：观察亚胺培南对铜绿假单胞菌标准菌株和耐药菌株体外培养释放DNA的影响。方法：选择铜绿假单胞菌的标准菌株和临床分离耐药菌株作为实验菌株,检测其亚胺培南的最低抑菌浓度（MIC）,琼脂糖凝胶电泳法观察不同浓度亚胺培南作用下铜绿假单胞菌的DNA释放情况,并用Quantity One软件分析所释放DNA片段的分子量和含量。结果：亚胺培南作用下铜绿假单胞菌从1／2MIC开始释放小片段DNA,大于1／2MIC仅释放l条大片段DNA,且含量少,等于1／2MIC可释放3条DNA,但无小片段DNA,小于1／2MIC可释放4．5条DNA,且含量多。1／16MIC时,标准菌株释放的第1、5条DNA片段含量偏少,3、4条DNA片段含量偏多,而耐药菌株相反。耐药菌株与标准菌株相比释放的DNA片段有所不同,耐药菌株比标准菌株多释放一条DNA片段（第2条）,分子量为2784bp,耐药菌株的第1、3、4、5条DNA片段分子量均比标准菌株小。耐药菌株释放的第3、4、5条DNA含量明显高于标准菌株,P〈0．01,其统计有显著学意义。结论：不同亚胺培南浓度作用下,铜绿假单胞菌会释放不同片段大小和含量的DNA分子,耐药菌株与标准菌株释放的DNA片段数量和含量有明显差异,其与耐药机制的关系值得进一步研究。     

不同土壤水分条件下CO2浓度对禾谷缢管蚜种群的影响

利用开顶式熏气室研究了不同土壤水分条件下不同CO₂浓度对禾谷缢管蚜种群的影响,以期对未来大气CO₂浓度升高条件下不同降雨地区的小麦蚜虫关系发展趋势做出初步预测.结果表明,随CO₂浓度升高,禾谷缢管蚜种群持续增长,但以CO₂浓度从350μl·L^-1上升到550μl·L^-1时增长最快;禾谷缢管蚜种群大小与土壤水分密切相关,各CO₂浓度下均以60%土壤水分的最大;当CO₂浓度从350μl·L^-1上升到550μl·L^-1时,60%土壤水分下的种群增长最快;当CO₂浓度从550μl·L^-1上升到700μl·L^-1时,60%和40%土壤水分下的种群增长相近,且高于80%土壤水分下的增长.据此可以认为,随大气CO₂浓度升高,禾谷缢管蚜种群会持续增长,从目前至下世纪中叶的时间内可能是蚜虫种群增长最快的阶段,特别在干旱、半干旱地区禾谷缢管蚜种群增长幅度较大、小麦受害较重.