鸭源鸡杆菌ompW、gtxA双基因缺失株的构建及其相关特性分析

鸭源鸡杆菌(Gallibacterium anatis,G.anatis)是家禽中常见的条件性致病菌,主要引起蛋鸡生殖道疾病,造成产蛋量下降。【目的】为探究RTX样毒素GtxA及外膜蛋白(OmpW)对鸭源鸡杆菌生物学特性和致病力的影响。【方法】本研究采用自然转化法对突变株RZ△ompW进一步缺失gtxA构建突变株RZ△ompW△gtxA,通过分析其生长特性、黏附能力、引起细胞凋亡程度及对小鼠致病性等,探究其与生物学特性及致病性可能的关系。【结果】结果显示,RZ△ompW△gtxA能稳定遗传gtxA的缺失;单双基因突变株溶血活性均消失、与RZ株相比菌落形态及生长速率并未出现显著改变;相比RZ、RZ△ompW和RZ△gtxA,双基因缺失株RZ△ompW△gtxA在不同时段对鸡原代输卵管上皮细胞的黏附能力显著降低(P0.05),诱导鸡输卵管上皮原代细胞发生凋亡的能力明显减弱,对小鼠的致病力显著降低。【结论】GtxA毒素和外膜蛋白OmpW在鸭源鸡杆菌毒力、黏附宿主细胞及诱导其细胞凋亡中起重要作用,且可能存在明显的协同关系。本研究为鸭源鸡杆菌感染机制的阐明奠定基础。     

河南省及周边省份猪群中大面积感染猪伪狂犬病毒的病因分析

2011年初开始,猪伪狂犬病(pseudorabies,PR)在河南省及周边省份再次突然出现严重暴发。为查明原因,应用PRV gE抗体ELISA检测试剂盒对2011年1月至2013年5月送检的16 800份猪血清、905份猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)"返饲"病料和56份PR基因缺失活疫苗分别进行野毒感染检测,通过PCR方法对11株PRV新流行毒株的TK、gE基因进行序列测定与分子特征分析,同时对这些毒株的毒价测定、免疫攻毒保护试验以及疫苗效价测定等开展研究。结果显示,PRV野毒感染阳性猪场检出率高达68.06%,血清总阳性率为38.47%,种母猪、种公猪、后备猪和商品猪的阳性率分别为40.12%、30.88%、54.67%和26.52%;新流行毒株聚在同一进化分支,均属于强毒株,但毒力较经典毒株变化不大,gE基因长度均为1 787bp,TK基因长度均为963bp,与不同年代中国参考毒株的核苷酸、氨基酸序列同源性分别为98.2%~99.8%、97.1%~99.8%和98.9%~99.6%和97.5%~99.4%;商品疫苗对新流行毒株的保护率为100%;疫苗和"返饲"病料中,PRV野毒阳性检出率分别为0%和40.44%。研究结果证实,2011年后河南省及周边省份猪群中,PRV野毒感染率大幅攀升;PRV新流行毒株的主要毒力基因并未发生明显变异;疫苗中未存在PRV野毒污染,而且可完全抵抗新流行毒株的攻击;种公猪、后备猪普遍带毒和PEDV"返饲"病料中严重污染野毒是造成2011~2013年间河南省及周边省份猪群中PRV大面积感染和疫情暴发的主要因素。     

鸡传染性法氏囊病毒实时qRT-PCR检测方法的建立及初步应用

根据高效培养鸡传染性法氏囊病毒（IBDV）时对病毒滴度检测的需要,本文针对BDV的VP4基因的保守序列设计并合成了一对引物,以所构建的重组质粒作为阳性标准品,建立了检测IBDV核酸载量的SYBR Green I荧光定量实时RT-PCR(qRT-PCR)方法,结果表明,其Ct值与标准品模板在4.03×1E1～1E9 拷贝/μL范围内呈良好的线性关系,对IBDV核酸的最低检出量为40拷贝/μL,灵敏度是常规RT-PCR检测方法的1000倍;该方法不与其它禽源病毒发生交叉反应,批内变异系数小于0.05%。应用本方法对DF-1细胞中IBDV的增殖滴度进行了测定,并与经典的TCID50测定方法进行了比较。结果显示两种方法测定的IBDV在微载体悬浮培养和方瓶静态培养条件下DF-1细胞上的增殖曲线都具有一定的平行关系,且qRT-PCR方法比TCID50方法更加快速和敏感,更适合于对IBDV增殖滴度的实时快速测定。     

禽支气管炎病毒Jin-13分离株在SPF鸡体内的动态分布

本研究旨在掌握禽传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)感染SPF鸡后在体内的动态分布。针对IBV流行毒Jin-13株N基因设计并合成一对引物,建立了检测IBV Sybr green I荧光定量PCR方法。人工感染90日龄SPF鸡1、4、7、10、14、21、28和35d后检测心脏、肝脏、脾脏、肺脏、气管、肾脏和十二指肠等内脏器官病毒载量,以研究体内病毒复制动态及分布情况。该方法在7.77×108~100拷贝/μL范围内具有良好的线性关系,可检测到初始模板中7.7拷贝/μL的病毒核酸,比常规RT-PCR方法敏感100倍。结果表明鸡群从感染后第4日开始发病,各组织器官内IBV病毒含量逐渐升高,至第7日肾脏病毒含量最高达到7.13×104拷贝/μL,其余依次为气管、肺脏、脾脏、心脏、肝脏和十二指肠。攻毒10日后各组织内含量均逐渐降低。肝脏于攻毒后21日时已检测不到IBV。于攻毒后第28日肾脏、气管和肺脏仍能检测到IBV。心脏可持续带毒35d。本研究从组织嗜性和动态分布方面为解释了IBV Jin-13株感染后的持续排毒及其严重的致肾损伤现象。     

压电免疫传感器的研究进展

生物传感器是近年来发展起来的一种新技术,能实时检测到传感器表面的抗原抗体反应,它可促使免疫诊断方法向定量化、操作自动化方向发展,成为生物医学领域的研究热点之一.本文简要介绍了生物传感器的基本概念与压电晶体免疫传感器的基本原理、设计与构造,并对常见的压电石英晶体免疫传感器生物敏感膜的制备方法进行了综述.     

不同生态品种群桃果实糖酸及其组分含量分析

以涵盖我国6个生态品种群的118份桃地方品种为试验材料,对其糖酸组分进行全面分析,以明确不同桃区果实糖酸组分分布特性,为优异糖酸种质筛选提供依据。应用斐林试剂测定果实可溶性糖含量;应用Na OH测定果实可滴定酸含量;应用高效液相色谱(HPLC)技术测定果实糖组分,离子色谱技术测定果实酸组分。结果表明:西北高旱桃区的品种,主要以可滴定酸、柠檬酸、苹果酸、总酸表现出较高的分布水平,蔗糖、总糖、糖酸比、固酸比表现出较低的分布水平;华北平原及长江流域桃区的品种,主要以糖酸比、固酸比表现出较高的分布水平,可滴定酸、柠檬酸、苹果酸、总酸表现出较低的分布水平;云贵高原桃区的品种,主要以可溶性糖、蔗糖、总糖表现出较高的分布水平,糖酸比、固酸比表现出较低的分布水平;华南亚热带桃区的品种,主要以蔗糖、总糖、糖酸比、固酸比表现出较高的分布水平,可滴定酸、柠檬酸、苹果酸表现出较低的分布水平;东北高寒桃区的品种,主要以果糖表现出较高的分布水平,糖酸比、固酸比表现出较低的分布水平。6个生态品种群的品种,果糖所占比例以长江流域桃区最高,葡萄糖以西北高旱桃区最高,山梨醇以华南亚热带桃区最高,而东北高寒桃区最低,蔗糖所占比例在不同生态区无明显差别。柠檬酸所占比例以长江流域桃区最高,而华南亚热带桃区最低,奎宁酸所占比例以华南亚热带桃区最高,琥珀酸、苹果酸所占比例在不同生态品种群间无明显差异。     

中国疣螈属一新亚种

对采自河南省大别山区商城县的一种蝾螈科标本进行形态特征比较,发现与文县疣螈Tylototriton wenxianensis 相似,但存在明显差异;经与文县疣螈等4种蝾螈进行12S mt DNA部分序列比对,显示其与文县疣螈的遗传分化已达亚种级水平,因此定为1新亚种,文县疣螈大别亚种Tylototriton wenxianensis dabienicus ssp.nov..新亚种的主要鉴别特征为:头长远大于头宽;4肢较短,前后肢贴体相对指、趾端不相遇;前肢前伸,指末端达眼前角;泄殖腔孔周缘橘红色.     

用基因疫苗制备H9亚型禽流感病毒单克隆抗体

用H9亚型禽流感病毒(AIV)HA基因反转录cDNA第一链PCR扩增其HA基因,PCR产物与pcDNA3.1( )质粒构建重组质粒作为基因疫苗免疫8周龄Balb/C小鼠,细胞融合后用血凝抑制试验(HI)和ELISA试验检测细胞培养上清,各获得一株阳性细胞株,经3次亚克隆后都能稳定分泌H9AIV特异性抗体。特异性检测与NDV、H5亚型AIV、产蛋下降综合症(EDS76)病毒毒株没有反应,2株单抗经亚型鉴定均为IgG2b,轻链的亚型为kappa链。所获得的单克隆抗体将在禽流感快速诊断和疾病预警监控中发挥重要作用。     

桃GRF基因家族的序列及其组织特异性表达分析

转录因子家族基因GRF(growth-regulating factor)是植物中特有的一类生长调控因子基因,在水稻和拟南芥中,GRF家族基因编码的蛋白质具有正向调控茎和叶生长发育的功能。为了探究在桃中GRF基因是否参与了狭叶桃"金蜜狭叶"的叶片发育,本试验首先分析桃基因组中鉴定出的GRF基因的序列信息;然后,以正常叶片的"上海水蜜"桃为对照,通过荧光定量PCR检测了这些GRF基因在"金蜜狭叶"桃的组织特异性表达情况;最后,利用126对简单序列重复标记对1个F2杂交群体进行连锁分析,定位狭叶性状,辅助筛选狭叶性状的候选基因。结果表明:桃基因组GRF基因包括10个成员,分布在除4和8外的其他染色体上,编码蛋白的氨基酸长度在191~612之间。蛋白序列分析表明,除ppa011917m的QLQ结构域中的Leu残基被Phe代替外,这10个GRF的N端均含保守的QLQ和WRC结构域。系统进化树将桃上的10个GRF基因分为3组。从10个GRF基因的表达结果可以看出,6个基因在茎尖的表达量高于幼叶,也高于其他成熟组织和器官;其中2个基因在狭叶桃中的表达显著高于正常叶对照。通过连锁分析将"金蜜狭叶"桃的狭叶性状定位在第6染色体的15.7~21.1 Mb之间,该区间仅含有1个GRF基因ppa003017m,是狭叶性状的候选基因。本研究将为"金蜜狭叶"桃狭叶性状基因的鉴定和高光效种质筛选奠定研究基础。