一个用于转染细胞分选的双顺反子载体的构建及其应用

为简化转染细胞的分选过程,构建了一个含有细胞表面标志 CD34 基因的双顺反子载体 p3.1-IRES-CD34. 利用来源于脑心肌炎病毒 (EMCV) 的内部核糖体进入位点 (IRES) ,实现目的基因与 CD34 基因的共同表达 . 将绿色荧光蛋白 (EGFP) 作为目的基因插入载体的多克隆位点,然后转染 NIH-3T3 细胞,通过免疫磁珠分选 (MACS) 方法来分选细胞 . 结果表明：对于转染细胞,均可实现快速分选 ( 瞬时转染细胞约 48 h ,稳定转染 10~15 天 ) ,并且获得较高纯度 (95% 以上 ) 的表达目的基因细胞 .     

Trametes sp.AH28-2漆酶A的诱导合成及其基因5''''-端调控区的克隆与分析

Trametes sp．AH28—2漆酶同工酶的合成需要铜离子的存在,较高浓度的Cu^2 有利于漆酶合成。在以葡萄糖为碳源补加0．5mmol／L Cu^2 的培养基中生长时,发酵液漆酶活性为44．3u／L,同时补加4．0mmol／L邻甲苯胺时,漆酶酶活提高到71．0u／L;而在补加Cu^2 和邻甲苯胺的纤维二糖培养基中,酶活上升至2584u／L,为葡萄糖培养基的36．4倍。邻甲苯胺和铜离子诱导产生的漆酶同工酶组分,均为漆酶A(LacA)。竞争性RT—PCR分析表明,漆酶A基因(lacA)转录本的累积伴随有发酵液漆酶活性的增加,邻甲苯胺对lacA的调控发生在转录水平。lacA结构基因长2110bp,含有10个内含子;lacA的cDNA序列为1560bp,编码520aa的漆酶蛋白,其氨基酸序列与其它真菌漆酶具有较高的相似性。采用改进的反向PCR技术,扩增得到的lacA 5’-端调控区长1881bp,分析表明,该区域上分布有1个TATA框、7个CAAT框和多个潜在的顺式作用元件序列位点,包括5个MRE元件、9个CreA结合位点、4个XRE元件、2个STRE元件和7个氮因子调控位点等。这些序列位点的存在部分地对应了菌株摇瓶发酵奈件下lacA的表达规律。     

金属螯合载体定向固定化木瓜蛋白酶的研究

以磁性金属螯合琼脂糖微球为载体,利用金属螯合配体（IDACu²⁺）与蛋白质表面供电子氨基酸相互作用的原理,定向固定了木瓜蛋白酶。固定化最适条件为Cu²⁺1.5×10^-2mol/g载体、固定化时间4h、固定化pH7.0、给酶量30mg/g载体。固定化酶的最适反应温度70℃、最适反应pH8.0,固定化酶的热稳定性明显高于溶液酶,固定化酶活力回收为68.4％,且有较好的操作稳定性,载体重复使用5次后固定化酶酶活为首次固定化酶79.71%。     

真菌源激发子对采后葡萄果皮抗性产生的诱导

利用细胞壁提取法从葡萄采后致病菌Alternaria alternate(Fr．)Keissl中提取出激发子。在采前一周用激发子处理葡萄,研究激发子诱导葡萄采后抗病效果。结果表明：葡萄经激发子处理后,果皮内与抗病有关的过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性显著增强,酚类物质和木质素含量也显著提高,贮藏期自然发病率和发病指数降低,其中以125μg·mL-1处理效果最好,果实发病率和发病指数比对照降低500％左右。     

7株放线菌在辣椒根部定殖及对辣椒叶片PAL与PPO活性的影响

采用盆栽接种试验、平皿涂抹法测数及常规酶活测定法研究了7株拮抗性放线菌在辣椒根部的定殖能力及接种24d对辣椒叶片苯丙氨酸解氨酶（PAl。）与多酚氧化酶活性（PPO）的诱导效应。结果表明：（1）供试7株放线菌单独接种均不能在辣椒根内定殖,但与辣椒疫霉P3混合接种时有5株可定殖;供试放线菌在辣椒根部的定殖能力与其体外平皿试验中产生的的拈抗圈大小基本无关;可定殖放线菌的定殖密度随时间延长而降低,至40d时均无活菌检出。（2）在放线菌单接处理中,5株菌接种后可诱导辣椒叶片PAL,活性提高,全部供试菌均能诱导PPO活性提高,其中可使两种酶同步提高的有5株菌;在放线菌＋P3混接处理中,有6株接种后可诱导PAL,活性提高,5株菌能诱导PPO活性提高,其中可使两种酶同步提高的有4株菌;在接入放线菌时同时混接辣椒疫霉,能增强2株供试放线菌对辣椒叶片PAL活性及6株供试放线菌对辣椒叶片PPO活性的诱导作用;供试放线菌的定殖能力与辣椒叶片PAL及PPO活性变化无明显规律性关系。     

增强UV-B辐射对麻花艽叶片的抗氧化酶的影响

以青藏高原的特有植物麻花艽为材料,研究麻花艽叶片抗氧化酶系统对增强UV-B辐射的响应。结果表明：在UV-B处理初期,麻花艽叶片SOD、POD的酶活性都能增加,但随着处理时间的延长,SOD、POD的活性呈现下降趋势。麻花艽叶片CAT的酶活性在UVB处理后下降明显,但作为清除叶绿体中H2O2的关键酶AP的酶活性表现为明显地增加趋势,说明在对麻花艽叶片增强UV-B辐射反应中AP起有着重要作用。MDA的含量随UV-B处理时间延长而增加,表明UV-B降低了细胞内活性氧自由基的清除能力,膜脂过氧化作用加剧,导致了对麻花艽叶片的伤害效应。     

失活 ChiA 和 v-cath 基因的重组BmNPV 表达 hGM-CSF

利用 DNA 同源重组技术使家蚕核型多角体病毒的多角体蛋白基因取代 v-cath 、 ChiA 两基因的部分编码区域和共同的启动子区域,获得了 v-cath 、 ChiA 两基因同时失活的、可形成多角体的、并能表达人粒细胞 - 巨噬细胞集落刺激因子的重组病毒 BmNPVpolh+CP－ChiA－GMCSF+. 研究结果显示： v-cath 、 ChiA 两基因的失活不影响病毒的复制及多角体的形成,但感染细胞的存活时间比野生病毒感染的多 2 天,可明显改善外源基因在培养细胞和家蚕中的表达水平;感染 BmNPV polh+CP－ChiA－GMCSF+的家蚕幼虫体表保持正常,无野生病毒感染后引起的破皮流脓现象 .     

光叶楮扦插生根的吲哚乙酸氧化酶、多酚氧化酶、过氧化物酶活性变化研究

对光叶楮扦插生根过程中吲哚乙酸氧化酶（IAAO）、多酚氧化酶（PPO）、过氧化物酶（POD）3种酶进行了动态跟踪分析。结果表明：IAAO活性在扦插初期逐渐上升,第10d上升到高峰,之后下降再上升,第30d达到新高峰,然后迅速下降;前25d POD活性变化规律与IAAO相似,但30d以后活性一直上升;PPO活性在扦插前期缓慢上升,第20d上升到了最高点,此后变化不大。还研究了IAAO、PPO、POD与不定根的发生和发展关系,认为光叶楮扦插生根可分为愈伤组织形成期、根诱导期和根的伸长期3个阶段,愈伤组织形成期3种酶活性都呈上升趋势,根诱导期IAAO和POD的活性达到高峰;而根伸长期IAAO和POD活性下降,PPO活性上升。     

枇杷属植物等位酶遗传变异及品种基因型指纹

利用超薄平板微型聚丙烯酰胺凝胶的等电聚焦电泳技术,对国家枇杷种质资源圃所收集保存的113个枇杷（Eriobotrya japonica Lindl．）品种（或株系）和4个野生近缘种[栎叶枇杷（E．prinoides Rehd．et Wils．）、大渡河枇杷（E．prinoides var．daduheensis H．Z．Zhang）、齿叶枇杷（E．serrata Vidal．）、大瑶山枇杷（E．dayaoshanensis Chen．）],共117份材料进行了等位酶遗传变异分析。在12个酶系中共检测到24个清晰位点和59个等位基因,多态位点为21个,位点最大等位基因数为5,体现出枇杷丰富的遗传种质多样性;X^2分析表明等位基因频率在不同产地品种群间存在明显差异,在用于分析的19个多态位点中,有15个位点达到显著或极显著水平;且不同的种材料拥有各自特有等位基因,如Dia-1^c,Dia-2^b,Dia-3^b只存在于大瑶山枇杷中,Est-2^b,Est-3^a只存在于大渡河枇杷中,Idh-1^d仅出现于枇杷品种荔枝枇杷中,体现了枇杷物种间的遗传组成差异;利用11个酶系统22个位点的53个等位基因所构建的枇杷品种（株系）等位酶基因型指纹可以将113个枇杷品种中的111个完全区分,各品种均有自己独特的等位酶基因型指纹,虽然进一步的分析表明,目前所研究的酶系统位点和等位基因变异与枇杷品种果实园艺性状变异间缺乏关联,但等位酶标记仍然不失为枇杷品种鉴别的一种有用工具。     

传染性法氏囊病不同代次细胞毒免疫效果的研究

将从山东省东营分离到的1株传染性法氏囊病病毒(IBDV)野毒(暂命名IBDV SDDY株,经鉴定该株与IBDV STC株具有较高的同源性)经SPF鸡胚传代,然后转为细胞培养,取第20代、21代、25代毒,以1倍剂量(3000TCID50/0.2mL)和5倍剂量不同的免疫剂量,分别在7日龄、14日龄对商品代海蓝褐蛋鸡进行免疫,并于免疫前用IBD-ELISA试剂盒检测IBDV母源抗体水平,于35日龄用传染性法氏囊病病毒超强毒(very virulent Infectious Bursal Disease Virus,vvIBDV)GX 8/99攻毒,在攻毒前再次检测IBDV的抗体水平,攻毒后观察记录各分组鸡的致病率和死亡率,并计算免疫器官体重指数,观察免疫器官的组织损伤情况.试验结果表明3代毒都具有较高免疫原性,但是20代毒仍具有较大的毒性,7日龄接种会引起法氏囊的萎缩,造成持续的组织损伤;21代毒、25代毒保护率高,无免疫抑制,是比较理想的疫苗来源;7日龄免疫较14日龄免疫更易造成组织损伤和免疫抑制,14日龄免疫较为合适.