一个用于转染细胞分选的双顺反子载体的构建及其应用

为简化转染细胞的分选过程,构建了一个含有细胞表面标志 CD34 基因的双顺反子载体 p3.1-IRES-CD34. 利用来源于脑心肌炎病毒 (EMCV) 的内部核糖体进入位点 (IRES) ,实现目的基因与 CD34 基因的共同表达 . 将绿色荧光蛋白 (EGFP) 作为目的基因插入载体的多克隆位点,然后转染 NIH-3T3 细胞,通过免疫磁珠分选 (MACS) 方法来分选细胞 . 结果表明：对于转染细胞,均可实现快速分选 ( 瞬时转染细胞约 48 h ,稳定转染 10~15 天 ) ,并且获得较高纯度 (95% 以上 ) 的表达目的基因细胞 .     

基于树突状细胞的肿瘤疫苗研究进展

1973年,Steinman和Cohn在小鼠脾脏发现具有树枝状突起的独特形态细胞,并将之命名为树突状细胞（dendritic cell,DC）。DC作为连接先天性免疫和获得性免疫的桥梁,是机体识别和摄取病原体和肿瘤抗原的关键细胞,具有抗原提呈能力强和激活初始型T细胞的特点。     

多瘤病毒感染与妇科肿瘤相关性的初步研究

人多瘤病毒(John Cunningham Virus,JCV)是广泛存在于人体内的一种多瘤病毒,最近二十年,国外研究显示JCV感染与多种神经系统及消化系统肿瘤高度相关,而JCV感染与妇科肿瘤关系的研究还鲜有报道。本研究在建立JCV核酸检测方法及规程的基础上,收集子宫肌瘤(98例)、子宫颈癌(84例)、子宫内膜癌(40例)、卵巢肿瘤(72例)患者临床资料、活检组织及血和尿样。运用PCR技术对上述患者活检样本及血、尿样本实施人乳头瘤病毒、单纯疱疹病毒Ⅱ型、人类疱疹病毒(Estein-barr virus,EBV)、巨细胞病毒和多瘤病毒JCV及BKV(B.K.virus,BKV)核酸检测。子宫颈癌高度相关人乳头瘤病毒在子宫颈癌组中检出率(19.0%)明显高于其它组,单纯疱疹病毒Ⅱ型、EBV及巨细胞病毒检出率几乎为0。BKV在尿样中的检出率明显高于血样及活检组织检出率,且检出率在各患者组中无显著差异。JCV检出率在血清样本及活检中几乎为0,然而,尿样中检测率均超过50%,且在子宫肌瘤患者组中高达65.3%。本研究显示JCV感染与子宫肌瘤高度相关,为子宫肌瘤的发病机理提供了新的病原学参考证据。     

骨髓间充质干细胞亲和肽MMP底物肽复合物的构建及其作为小分子药物载体的初步研究

为了探讨骨髓间充质干细胞亲和肽与基质金属蛋白酶（matrixmetalloproteinase,MMP）底物肽复合后作为小分子药物载体的可行性,采用噬茵体肽库技术,用分离培养的大鼠骨髓间充质干细胞（mousemesenchymalstemcells,MSCs）筛选噬菌体环七肽库,获得MSCs高亲和性多肽．合成FrrC（Frrc—CSTNPKVLC,FITC．P1）和生物素（Biotin—CSTNPKVLC,Bio-PI）标记的亲和肽,流式细胞术和ELISA方法检测其与MSCs的亲和性;将DAPI标记的MSC-Bio-P1复合物植入裸鼠肿瘤组织周围,检测复合物在体内的稳定性．将亲和肽与基质金属蛋白酶（matrixmetalloproteinases,MMPs）特异性底物肽（GPLGIAGQ）连接,合成FITC标记的亲和肽．底物肽复合物（FITC-Ahx-CSTNPKVLCGPLGIAGQ,FITC—P1-P2）,通过流式细胞术检测其对MSCs的亲和性,毛细管电泳方法检测MMP对FITC-P1-P2的酶切效果．结果表明,通过噬菌体肽库筛选获得的MSCs亲和肽,在体内外对MSCs均具有良好的亲和性和稳定性;亲和肽与底物肽的复合物（FTTC—P1-P2）对MSCs仍有较好的亲和性,并且能够被MMPs酶切．以上研究表明,MSCs亲和肽．MMP底物肽复合物（CSTNPKVLCGPLGIAGQ,P1-P2）可以作为MSCs与小分子药物相连的连接子,从而对MSCs作为小分子药物（如化学药物）载体的可行性提供了实验依据．     

人羊水来源干细胞的体外培养及其生物学性状分析

目的:体外分离培养人羊水来源干细胞(hAFSC),观察分析其基本的生物学性状。方法:取孕中期产前诊断所抽取的羊水,离心收集细胞,然后贴壁培养获得hAFSC。在细胞培养的基础上,观察hAFSC的形态;研究其增殖能力;用流式细胞术测定细胞周期及不同代次细胞表面阶段特异性胚胎抗原4(SSEA-4)表达率的变化;利用RT-PCR方法检测细胞干性基因的表达;利用诱导培养基诱导,检测其向肝样细胞与成骨细胞分化的潜能。结果:在体外培养条件下,hAFSC表现为成纤维细胞形态;具有良好的增殖能力,群体倍增时间约为36 h;细胞周期检测G0/G1期细胞约占86.7%,S+G2/M期细胞约占13.3%;流式细胞术检测结果表明,hAFSC表达SSEA-4,且SSEA-4阳性率随传代次数呈现先上升后下降的趋势;hAFSC在mRNA水平上表达Nanog、Oct4和Rex1等胚胎干细胞标志性基因;经诱导培养基诱导后,hAFSC可以向肝样细胞与成骨细胞分化。结论:hAFSC是一群呈成纤维细胞样,有良好增殖能力,且具有多向分化潜能的细胞,加之其来源方便,伦理学限制较少,因此在细胞治疗及组织工程等方面有着广泛的应用前景。     

FADD基因的结构与功能

FADD是新近克隆出的一种能与Fas相互作用而诱导细胞凋亡的蛋白,其基因位于人11号染色体长臂上,由死亡效应结构域（DED）和死亡结构域（DD）两部分组成,FADD基因介导着多种死亡受体诱导的细胞凋亡信号传导通路。FADD基因在T细胞增殖及胚胎发育中也发挥着重要的作用。在基因治疗领域,FADD基因可促进胶质瘤细胞和类风湿性关节炎滑膜细胞的凋亡。有必要在FADD的基因治疗方面加大研究力度,为疾病的基因治疗开辟新的途径。     

胚胎干细胞的诱导分化研究

胚胎干细胞(embryonic stem cell, ES细胞)是指由胚胎内细胞团(inner cell mass, ICM)细胞经体外抑制培养而筛选得到的细胞, 具有发育上的全能性. 近两年在ES细胞诱导分化方面的研究取得了一些突破性的进展, 其中, ES细胞向生殖细胞分化(2003年)以及首次克隆成功人ES细胞(2004年)先后被评为《科学》杂志当年度十大科学进展之一; 另外, 维持ES细胞不分化状态的关键基因(Nanog)及相关化合物(BIO)的发现, 其自身分化状态调控机理的深入研究, 以及向不同方向诱导分化和应用等的研究成果, 同样受人关注.     

自体骨髓间充质干细胞为种子细胞构建组织工程化全层皮肤

利用自体骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)为种子细胞分别在体外一定条件下向表皮细胞和真皮成纤维细胞诱导分化, 并且和Ⅰ型胶原膜复合后移植修复裸鼠皮肤创面, 观察以自体BMSCs为种子细胞构建组织工程化全层皮肤的可行性. 研究发现, 将分离纯化的BMSCs接种于表皮细胞诱导体系中, 3天后细胞即发生形态改变, 汇合成表皮细胞特有的“铺路石”状; 透射电子显微镜观察到张力原纤维、黑色素小体和透明角质颗粒; 诱导分化细胞表达表皮细胞表面标志CK19和CK10, 且CK19的诱导分化效率达到60%, 表明诱导分化的细胞大部分为表皮干细胞; 通过检测细胞诱导前后紫外线照射诱发的凋亡状况, 证实诱导后的细胞具有抵抗紫外线照射的功能; 另一方面, BMSCs在真皮成纤维细胞诱导体系作用下, 超微结构观察到细胞外胶原微纤维的沉积, RT-PCR证实诱导分化细胞具有分泌Ⅰ型胶原的功能; 放射免疫法检测到诱导后的细胞还具有分泌细胞因子IL-6与IL-8的功能, 其最高分泌量分别为115.06 pg/mL和0.84 ng/mL. 体内移植实验也证实, BMSCs与生物支架材料复合后具有明显促进皮肤缺损创面愈合的作用. 研究结果表明, BMSCs具有向表皮细胞和成纤维细胞分化的潜能, 以及作为种子细胞构建具有生物学功能的组织工程化全层皮肤的可行性, 并且自体来源的BMSCs构建的皮肤组织无免疫排斥风险, 具有广阔的临床应用前景.