三株散囊菌属真菌的茶叶液态发酵与其成分分析

散囊菌属真菌(Eurotium spp.)又称“金花菌”,能在六堡茶表面生长出金黄色的子囊果而得名,是一类对发酵茶叶的品质有积极影响的真菌。本研究前期从广西梧州六堡茶中筛选到的三株散囊菌属真菌Aspergillus chevalieri E2(简称E2),Aspergillus chevalieri E3(简称E3)与Aspergillus cristatus E6(简称E6),将菌株接种于自制液体茶粉培养基中培养,检测发酵液中产生的色素物质;测定发酵液中纤维素酶、果胶酶、淀粉酶的酶活力、总糖和还原糖糖含量、氨基酸含量、总抗氧化能力、自由基清除能力和茶多酚含量。结果表明:三株真菌在液体茶粉培养基中生长良好,E3生长尤其迅速。在8 d的培养期限内,E2、E3和E6的最高果胶酶活力分别为2.52、3.44和5.15 U/mL;最高纤维素酶活力分别为0.57、0.82和1.10 U/mL;最高淀粉酶活力分别为0.31、0.35和0.49 U/mL。三株真菌的发酵后培养液中还原糖含量大幅增加,增幅分别达到131.70%、627.02%和459.12%;总糖含量同样呈上升趋势,增幅分别达到6.84%、35.25%和2.07%;E2与E3的氨基酸含量分别下降了17.43%与32.68%,E6则上升了0.52%;E3的总抗氧化活性提升最大,达65.87%;DPPH·自由基清除能力提升最大的是E2,达128.33%;茶多酚含量都显著提升,增幅分别为50.85%、51.58%和53.06%。本研究对改善六堡茶的品质及茶叶的发酵的研究有一定意义和参考价值。     

不同发酵茶中优势真菌的分离鉴定 及产消化酶活性比较

目的分离鉴定云南普洱茶、广州小青柑、广西六堡茶和湖南熙茯茶中的主要真菌,并探讨其产消化酶活性。方法采用平板涂布法分离不同发酵茶中的真菌,通过其ITS序列进行分子鉴定;利用平板透明圈法测定不同真菌的产淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶和脂肪酶活性。结果从4种发酵茶中共分离出8种真菌,其中,在云南普洱茶中分离出2种真菌,分别为篮状菌(Talaromyces. sp.)和T.variabilis;广州小青柑中分离出3种真菌,分别为阿曲霉(Aspergillus amstelodami)、烟曲霉(A.fumigatus)和绳状篮状菌(T.funiculosus);广西六堡茶中分离出2种真菌,分别为黑曲霉(A.niger)和冠突曲霉(A.cristatus);湖南熙茯茶中仅分离出谢瓦曲霉(A.chevalieri)。其中Talaromyces. sp.、T.variabilis、A.niger、A.amstelodami、A.fumigatus、T.funiculosus有产纤维素酶活性,Talaromyces. sp.、T.variabilis、A.cristatus、A.fumigatus、T.funiculosus有产淀粉酶活性,Talaromyces. sp.、T.variabilis、A.niger、A.fumigatus、T.funiculosus有产蛋白酶活性,A.niger有产脂肪酶活性。在8种真菌中,T.variabilis、烟曲霉和绳状篮状菌可同时产纤维素酶、淀粉酶和蛋白酶;黑曲霉能同时产纤维素酶、蛋白酶和脂肪酶;冠突曲霉仅有产淀粉酶活性;阿曲霉仅有产纤维素酶活性。通过比较不同真菌的产酶活性表明,烟曲霉的产蛋白酶活性能力最强;Talaromyces sp.的产纤维酶活性能力最强;Talaromyces. sp.和绳状篮状菌的产淀粉酶活性最强。结论发酵茶的真菌以曲霉菌属Aspergillus、散囊菌属Eurotium和篮状菌属Talaromyces为主,多数真菌具有产消化酶活性,这些酶可能在茶叶发酵过程中起重要作用,并影响发酵茶叶的品质。     

不同发酵茶中优势真菌的抗氧化酶活性

目的在云南普洱茶、广州小青柑、广西六堡茶、湖南熙茯茶及陕西泾阳茯砖茶分离到9种真菌的基础上,探讨9种真菌发酵液和发酵茶沸水冲泡液的抗氧化酶活性。方法采用抗氧化试剂盒测定真菌发酵液及发酵茶沸水冲泡液的抗氧化酶活性;利用Past 3软件对9种真菌发酵液抗氧化酶活性和5种发酵茶沸水冲泡液的抗氧化酶活性进行主成分分析。结果通过比较不同真菌发酵液的抗氧化酶活性表明,小青柑中分离到阿曲霉Q1的CAT(过氧化氢酶)活性最高,酶活力单位为(4.37±0.15)U/mL,熙茯茶中分离到谢瓦曲霉X1的POD(过氧化物酶)活性最高,酶活力单位为(21.67±1.05)U/mL,其次为泾茯茶中分离到赤散囊菌J17,酶活力单位为(18.59±2.74)U/mL;六堡茶中分离到的黑曲霉L1的T-SOD(总超氧化物歧化酶)的活性最高,酶活力单位为(71.11±3.90)U/mL,其次为普洱茶中分离到篮状菌P1,酶活力单位为(59.29±1.42)U/mL;通过比较不同发酵茶沸水冲泡液的抗氧化酶活性表明,5种发酵茶的CAT(F=37.409,P0.01),POD(F=164.268,P0.01),T-SOD(F=26.639,P0.01)活性差异均有统计学意义。其中,泾茯茶冲泡液的CAT活性最高,而其余4种茶叶冲泡液均无CAT活性;普洱茶与泾茯茶冲泡液的POD活性最高,酶活力单位分别为(18.11±0.71)和(18.11±0.64)U/mL;普洱茶和六堡茶冲泡液的T-SOD活性最高,酶活力单位分别为(48.72±0.43)和(45.82±2.02)U/mL;通过对9种真菌发酵液抗氧化酶活性的PCA分析表明,谢瓦曲霉X1、赤散囊菌J17、阿曲霉Q1、烟曲霉Q2、绳状篮状菌Q3和冠突曲霉L2的抗氧化酶活性相近,篮状菌P1、篮状菌P2和黑曲霉L1的抗氧化酶活性相近;通过对5种发酵茶沸水冲泡液抗氧化酶活性的PCA分析表明,小青柑与熙茯茶沸水冲泡后的抗氧化酶活性相近,六堡茶、普洱茶和泾茯茶沸水冲泡后的抗氧化酶活性相近。结论不同发酵茶的优势真菌不同,其真菌发酵产物的抗氧化酶活性不同,且不同发酵茶冲泡液的抗氧化酶活性也不同。     

曲霉属真菌在普洱茶后发酵中的作用

为阐明微生物在普洱茶后发酵过程中的作用及其机制,本文进行了普洱茶温湿度试验,并利用从普洱茶后发酵堆中分离鉴定的优势曲霉属真菌,进行接种试验和专用菌剂的发酵生产试验.结果提示,只有在微生物的作用下,普洱茶才具特有的感官特性,曲霉属真菌能控制后发酵的过程,改变茶叶的感官特性.曲霉属真菌的种类及组合对普洱熟茶的茶多酚组成与含量,以及没食子酸、茶氨酸、咖啡因等特征成分的含量均有显著的影响.因此,应用专用菌剂进行后发酵生产,能加快普洱茶的熟化速度,提高发酵成功率,保证产品质量的稳定性,使普洱熟茶的规范化生产成为可能.     

土曲霉致双外耳道曲霉病

目的报道1例发生在双外耳道的曲霉病。方法取双耳耵聍行真菌直接镜检,将耵聍接种到沙堡培养基培养,并对培养出的病原菌进行形态学鉴定和rDNA序列分析。结果耵聍真菌直接镜检阳性,耵聍在沙堡培养基25℃培养长出沙褐色菌落,28℃小培养后光镜及扫描电镜下见分生孢子头呈柱状,顶囊半球形,直径约10μm,小梗双层,两层小梗的长度无明显差别,平行紧密生长在顶囊的上2/3处。分生孢子呈球形,小而光滑。分生孢子梗壁光滑、透明。提取真菌总DNA用PCR方法扩增rDNA序列,测序后登录Gene Bank进行比对,该菌与土曲霉菌株ATCC1012 rDNA序列一致性达100%,鉴定为土曲霉。患者外用4%氟康唑注射液直接滴耳,2次/d,治疗1个月后痊愈。结论确诊1例双外耳道土曲霉病,局部应用氟康唑注射液治疗外耳道曲霉病有效。     

茯砖茶中优势菌种的鉴定

所谓“黄霉菌”是茯砖茶发酵中的益菌。它实际上是散囊菌属产生的黄色闭囊壳。优势种经鉴定为冠突散囊菌[Eurotium cristatum(Raper ＆ Fennell)Malloch & cain],它的无性型是针刺曲霉(Aspergillus spiculosus Blaser),异名是冠突曲霉(A.cristatus Raper &Fennell)。文中还对有关该菌的命名问题和在我国的分布作了讨论。     

散囊菌属的两个新种

本文报道两个新种,肋状散囊菌(Eurotium costiforme)和少疣散囊菌(E.parviver-ruculosum)。前者的主要特征是子囊孢子的凸面有许多网结的肋状突起;在查氏琼脂上产生大量的闭囊壳,但分生孢子结构极少。后者在查氏琼脂上生长很局限;子囊孢子大,凸面近于平滑或有少量小疣等主要特点。     

温度和水活度对冠突散囊菌菌丝生长和产孢的影响

冠突散囊菌(Eurotium cristatum)是茯砖茶发酵过程中的优势菌。通过调节甘油含量制备具有不同水活度(aw)的培养基,研究培养基水活度、培养温度以及不同温度和水活度组合对冠突散囊菌菌丝生长、分生孢子产生、萌发和菌落形态的影响。供试的冠突散囊菌菌株FZ-2、FZ-3和FZ-4在水活度为0.77～0.99的培养基中均能生长,最适培养基水活度为0.90～0.95。培养基水活度在0.77～0.95范围内有利于菌株FZ-2产生分生孢子,最适水活度为0.83;培养基水活度于0.83～0.95范围内有利于菌株FZ-4产孢;而菌株FZ-3适合产孢的培养基水活度为0.95。菌株FZ-2分生孢子萌发的最适水活度为0.87～0.95。菌株FZ-2适合的生长温度为28～37℃,温度38℃时菌体生长速度下降,至40～45℃时菌丝停止生长;菌株FZ-3和FZ-4最适生长温度均为28℃。在20～37℃条件下菌株FZ-2均能产生分生孢子,最适产孢温度为37℃;菌株FZ-3在28～37℃范围内产生分生孢子;菌株FZ-4在20～37℃内产生分生孢子,最适产孢温度为37℃。菌株FZ-2分生孢子可以在较宽的温度范围内(20～40℃)萌发,最适温度为25～33℃。研究结果表明不同水活度-温度组合对菌株FZ-2菌丝生长和菌落形态产生显著的影响,与温度作用相比,水活度的影响更为明显。本研究证明了冠突散囊菌适合在干燥的茶叶中生长和繁殖,为解释其在茯砖茶加工过程中的优势地位提供理论依据,研究结果也将促进茶叶发酵菌剂的开发利用和砖茶的标准化生产。     

从黑茶中分离和筛选产单宁酶菌株

茶叶中富含单宁化合物。从分离自黑茶的真菌菌株中,筛选高产单宁酶的菌株;进而分离纯化单宁酶,分析单宁酶对茶汤的转溶效果。从不同产地的3个黑茶样品中,共分离获得44个真菌分离物;经初步鉴定,这些真菌分离物以曲霉属（Aspergillus）、青霉属（Penicillium）和散囊菌属（Eurotium）的真菌居多。以单宁酸为底物的鉴别培养基初筛表明,其中26个真菌分离物在鉴别平板上产生透明圈,显示单宁水解酶活性;通过固体发酵复筛,筛选到1株产单宁酶活性较高的菌株,初步鉴定为青霉属（Penicillium）菌株,命名为青霉MP-24菌株。青霉MP-24可以以茶叶、茶梗和麸皮等农副产品作为原料固体发酵产生单宁酶。以麸皮为原料的发酵产物经过硫酸铵分级沉淀、DEAE阴离子交换层析和葡聚糖G-150凝胶层析等分离纯化步骤,得到分子量为70 kDa的单一蛋白质条带,单宁酶活力达到603.68 U/mg。纯化获得的单宁酶对茶汤有良好的转溶效果。研究结果表明,在黑茶相关微生物中含有丰富的产单宁酶菌株,是工业酶制剂的重要资源。     

草菇培养料二次发酵过程中真菌的群落结构

【目的】明确草菇培养料二次发酵过程中真菌群落变化情况,确定发酵不同阶段的优势菌群,为能够在分子水平上准确高效监测发酵过程,解析发酵机制奠定基础。【方法】采用变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)及克隆菌株18S r DNA序列分析技术对草菇培养料二次发酵不同阶段真菌群落结构进行分析。【结果】DGGE图谱显示,不同处理真菌群落多样性存在差异,发酵高温阶段条带多样性较高,而且优势条带及相对含量也在发生动态变化。回收克隆不同发酵阶段的20个优势菌株中,9个菌株为非培养未知真核生物或真菌,其余克隆菌株为非培养散子囊菌目(Eurotiales)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、曲霉菌属(Aspergillus sp.)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、Melanocarpus albomyces、炭疽菌属(Colletotrichum sp.)、根毛霉菌属(Rhizomucor sp.)、轮枝菌属(Verticillium sp.)、普通青霉(Penicillium commune)、三角孢小囊菌(Microascus trigonosporus)和Trichosporon lactis真菌,其中14株(70%)克隆菌株为耐热真菌。【结论】草菇培养料二次发酵过程中真菌群落结构及优势菌群在发生着动态的变化。     

Eurotium spp. and echinulin in feed refused by swine.

Feed refused by swine contained a high-propagule density of Eurotium chevalieri Mangin (anamorph, Aspergillus chevalieri (Mangin) Thom and Church), Eurotium amstelodami Mangin (anamorph, Aspergillus amstelodami (Mangin Thom and Church), and Aspergillus candidus Link. Echinulin (8 micrograms/g of feed) was detected in the feed. Isolates of E. chevalieri and E. amstelodami but not A. candidus produced echinulin on rice or cracked corn. Mice refused to drink water containing 90 micrograms of echinulin per ml. This is the first report of the alkaloid echinulin in feed refused by swine.     

Molecular identification of Aspergillus and Eurotium species isolated from rice and their toxin-producing ability

Thirty milled rice samples were collected from retailers in 4 provinces of Malaysia. These samples were evaluated for Aspergillus spp. infection by direct plating on malt extract salt agar (MESA). All Aspergillus holomorphs were isolated and identified using nucleotide sequences of ITS 1 and ITS 2 of rDNA. Five anamorphs (Aspergillus flavus, A. oryzae, A. tamarii, A. fumigatus and A. niger) and 5 teleomorphs (Eurotium rubrum, E. amstelodami, E. chevalieri, E. cristatum and E. tonophilum) were identified. The PCR-sequencing based technique for sequences of ITS 1 and ITS 2 is a fast technique for identification of Aspergillus and Eurotium species, although it doesn't work flawlessly for differentiation of Eurotium species. All Aspergillus and Eurotium isolates were screened for their ability to produce aflatoxin and ochratoxin A (OTA) by HPLC and TLC techniques. Only A. flavus isolate UPM 89 was able to produce aflatoxins B1 and B2.     

The genus Eurotium - members of indigenous fungal community in hypersaline waters of salterns

Six different species of the known teleomorphic food-borne xerophilic genus Eurotium were repeatedly isolated in a mycodiversity study of hypersaline waters. At salinities above 17% NaCl, E. amstelodami was detected most consistently, followed by E. repens and E. herbariorum, while E. rubrum, E. chevalieri and a potentially new species, "Eurotium halotolerans", were detected only occasionally at lower salinities. The qualitative secondary metabolite profiles produced by Eurotium spp. from salterns were not different from those of Eurotium spp. from foods and other habitats. Spatiotemporal frequency of occurrence and in vitro determined adaptive ability of propagules to survive prolonged exposure to hypersaline conditions indicate that E. amstelodami, E. herbariorum, and E. repens contribute to the indigenous fungal community in hypersaline water environments, while E. rubrum, E. chevalieri and "E. halotolerans" are only temporal inhabitants of brine at lower salinities.     

冠突散囊菌对茶叶品质成分及其抗氧化活性影响

从茯砖茶样中分离纯化制得冠突散囊菌Eurotium cristatum菌株,选用普通炒青绿毛茶做茶坯,应用人工接种发酵技术进行固体发酵制成发酵散茶。结果表明：冠突散囊菌发酵一个月后的炒青绿茶不仅品质成分明显改善,茶黄素和茶红素高于其他样品,而且苦涩味减轻;采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）法和2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)（ABTS）法测定发酵散茶的抗氧化活性,结果显示,对两种自由基的清除能力分别达到75%和56%以上,与湖南茯砖茶相近。发酵散茶的ABTS自由基清除能力分别高于对照和浙江茯砖茶64.7%和80.6%,而对DPPH的清除能力略低于对照,但是高于浙江茯砖茶。     

分离自茯砖茶的真菌菌株MJAU EC021的鉴定及培养过程中生理特性

【目的】从茯砖茶样中分离纯化得到生长优势菌株,研究其液体培养时的生理生化特性,为茯砖茶实际生产提供依据。【方法】用PDA平板稀释涂布法从茯砖茶中分离纯化菌株。采用常规真菌发酵培养方法,单因素筛选其培养条件,再利用响应面法优化最优培养条件,测定冠突散囊菌发酵液中还原糖、多酚、胞外酶酶活及抗氧化的能力。【结果】利用形态学与ITS序列分析鉴定优势菌株MJAU EC021为冠突散囊菌Eurotium cristatum;最优的培养条件:转速187 r/min,培养时间10 d,培养温度28°C,冠突散囊菌生物量为21.52 g/L。冠突散囊菌发酵培养过程中4种胞外酶活性均在第10天时达到最大值,第9天时胞外多酚含量达到峰值为0.588 g GAE(没食子酸)/m L;发酵液对1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH)、羟基自由基的清除率达到最大值分别是90%、94%。【结论】真菌菌株MJAU EC021是株冠突散囊菌E.cristatum,发酵液具有较好的抗氧化能力,是潜在的抗氧化添加剂。     

棒状乳杆菌FZU63发酵对红茶汤风味品质改善的作用

乳酸菌发酵可赋予茶饮料独特的香气与滋味,且可改变其物质组成,产生益生因子等。目前,针对乳酸菌在不同发酵阶段对茶汤中风味物质形成影响的研究较少。本研究以从中国传统泡菜中筛选获得的棒状乳杆菌FZU63为发酵菌株,对不同发酵阶段红茶汤中的挥发性香气成分、还原糖、游离氨基酸、有机酸等含量的变化过程进行分析,并对发酵红茶汤的感官品质进行评价。结果表明,棒状乳杆菌FZU63以红茶汤中的葡萄糖、果糖、甘露糖和木糖作为发酵过程中的主要碳源物质。红茶汤经棒状乳杆菌FZU63发酵作用后,香气成分丰度显著增加,且主要香气组分结构发生改变,发酵红茶汤在花香、坚果香的基础上增添了水果香;此外,部分苦味氨基酸含量下降,甜味和鲜味氨基酸含量增加;并且,乳酸、苹果酸、柠檬酸等有机酸含量在发酵过程中呈现积累。同时,感官评定结果表明棒状乳杆菌FZU63发酵可改善红茶汤的感官品质,且在发酵48h后达到较优。本文系统分析了经棒状乳杆菌发酵不同阶段对红茶汤风味的影响,可为乳酸菌发酵茶饮料的品质控制与产业化应用提供理论参考。     

曲霉及其有性型散囊菌的新分类群和新记录种

在收集和分离我国曲霉工作中,发现一个国内新纪录和三个新分类群:1.埃及曲霉,国内新记录。2.合阳曲霉新种,与爪甲曲霉相近,但颜色和具刺不育菌丝有所不同。3.温特曲霉烟色变种,与原变种的主要区别在于颜色为蓝灰色并具异常膨大的梗基。4.瘤突散囊菌新种,其子囊孢子的纹饰独特,凸面具粗疏瘤状突起。     

Influence of solute and hydrogen ion concentration on the water relations of some xerophilic fungi.

Germination and growth of six xerophilic fungi, Aspergillus flavus, Aspergillus ochraceus, Eurotium chevalieri, Chrysosphorium fastidium, Wallemia sebi and Xeromyces bisporus were examined on media of a wide range of water activities (aw). The influence of three solutes, NaCl, glycerol and a glucose/fructose mixture, was studied at pH 4-0 and pH 6-5 using a plate-slide technique. Germination times and growth rates were affected by solute type, but the influence of pH was less marked. Except for Wallemia sebi, the fungi grew most strongly on glucose/fructose and were partially or completely inhibited by NaCl. The results showed that a universal isolation medium for xerophilic fungi could be based on glycerol or glucose/fructose but not on NaCl as aw-limiting solute.