产大米蛋白水解酶的菌株筛选、酶学性质及制备大米寡肽

【目的】旨在分离、筛选并鉴定具有大米蛋白降解作用的菌株及其关键蛋白酶,为高效制备大米寡肽提供制备酶及最优制备条件。【方法】以"水解圈"为评价指标,从粮食仓库附近土壤筛选获得具有降解大米蛋白能力的菌株;通过16S rRNA序列分析确定菌株归属;利用单因素实验获得最佳氮源并初步分析酶学性质;利用HPLC检测寡肽得率,并对制备条件进一步优化。【结果】经鉴定具有大米蛋白降解作用的菌株为沙雷氏菌(Serratia sp. JWG-D15),以大米蛋白为氮源培养菌株JWG-D15,蛋白酶So PRO产量最高,其最适温度40℃,最适pH 8.0;在加酶量20 U/mg,大米蛋白浓度40 mg/mL,40℃,4 h条件下寡肽得率最高72.38%。【结论】以大米蛋白为氮源培养菌株JWG-D15,蛋白酶So PRO产量最高;蛋白酶So PRO制得的大米寡肽,其得率是目前行业最高。本研究既丰富了大米寡肽的制备用酶的种类,又为深入大米寡肽产业化提供一定理论基础。     

一株PET降解菌株的筛选鉴定及降解特性

本研究进行了聚对苯二甲酸乙二醇酯(polyethyleneterephthalate,PET)降解菌株的分离、筛选和鉴定,以及降解机制的探究.用"分级筛选"策略,先利用塑料类似物对苯二酸二甲酯(diethyl terephthalate,DET)进行富集培养,在以PET颗粒为唯一营养源的无机盐固体培养基上进行涂布,从垃圾填埋场PET塑料样品中筛选获得具有降解PET颗粒能力的菌株JWG-G2.通过菌株形态观察、生理生化特性及16S rRNA序列分析,鉴定该菌株属于微杆菌属(Microbacterium sp.).菌株JWG-G2在pH 7.0、30℃时生长状态最佳.经菌株JWG-G2处理后,PET颗粒表面酯键特征官能团明显减少;PET颗粒失重率达到1％.菌株JWG-G2能够显著降解PET中间体对苯二酸单羟乙酯钠盐(monohydroxyethyl terephthalate,MHET)和对苯二甲酸双羟乙酯(bishydro-xyethyl terephthalate,BHET)多聚体,其降解率分别为4.5％和11.2％.菌株JWG-G2具有较好的PET颗粒及其中间体降解作用,为降解机制的深入研究提供一定理论基础.     

分离自茯砖茶的真菌菌株MJAU EC021的鉴定及培养过程中生理特性

【目的】从茯砖茶样中分离纯化得到生长优势菌株,研究其液体培养时的生理生化特性,为茯砖茶实际生产提供依据。【方法】用PDA平板稀释涂布法从茯砖茶中分离纯化菌株。采用常规真菌发酵培养方法,单因素筛选其培养条件,再利用响应面法优化最优培养条件,测定冠突散囊菌发酵液中还原糖、多酚、胞外酶酶活及抗氧化的能力。【结果】利用形态学与ITS序列分析鉴定优势菌株MJAU EC021为冠突散囊菌Eurotium cristatum;最优的培养条件:转速187 r/min,培养时间10 d,培养温度28°C,冠突散囊菌生物量为21.52 g/L。冠突散囊菌发酵培养过程中4种胞外酶活性均在第10天时达到最大值,第9天时胞外多酚含量达到峰值为0.588 g GAE(没食子酸)/m L;发酵液对1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH)、羟基自由基的清除率达到最大值分别是90%、94%。【结论】真菌菌株MJAU EC021是株冠突散囊菌E.cristatum,发酵液具有较好的抗氧化能力,是潜在的抗氧化添加剂。     

基于磷脂酶水解圈定向筛选高效聚对苯二甲酸乙二醇酯降解酶

【目的】目前自然环境中聚对苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene terephthalate, PET)废弃物的积累严重威胁生态健康,因此PET的降解问题已成为全球性的热点问题。生物酶法降解PET技术以其绿色环保而备受关注,但天然PET降解酶的催化活性普遍偏低,亟待进一步定向改造。现阶段定向进化为快速提高PET降解酶催化性能提供了可能,其中筛选方法是成功获得高性能突变体的关键所在。本研究旨在提出一种新型高效灵敏的筛选方法并应用于褐色喜热裂孢菌(Thermobifida fusca)来源角质酶Tfu-0883的定向改造,以期快速获得PET降解活性提高的突变体。【方法】基于易错PCR构建突变体文库,涂布于卵黄磷脂平板,以水解圈的大小作为筛选指标获得PET降解活性提高的突变体;对突变体进行酶学定性并筛选出潜在的分子改造位点,最终获得高性能突变体。【结果】从卵黄磷脂平板中挑取水解圈直径最大的单菌落,即突变体H10(N2D/D94H/A149E),其PET降解能力是野生型的1.5倍,最适温度与pH分别为60℃和8.0。突变体H10中第2位和第149位氨基酸残基远离底物结合凹槽,其突变会导致酶蛋白稳定性下降;第94位氨基酸残基则位于底物结合凹槽附近,由负电荷氨基酸Asp突变为正电荷氨基酸His,有利于吸附在带负电荷的PET表面,是突变体H10降解能力提升的关键因素;随后将野生型的第94位氨基酸残基Asp分别突变为His及同为正电荷且空间位阻更小的Lys和Arg,突变体D94H、D94K和D94R对PET降解能力均有提升,其中,突变体D94K降解PET能力是野生型的3.6倍。【结论】本研究基于磷脂酶水解圈构建了一种新的PET降解酶定向筛选方法,以此获得了降解活性提高的突变体,并证实角质酶Tfu-0883第94位氨基酸残基位点具有提升其PET降解活性的潜在能力。     

Aspergillus oryzae RIB40氨肽酶(AoAPase)异源表达及在鳕鱼肽脱苦中的应用

【目的】针对鳕鱼肽苦味这一不足之处,本研究旨在获得一种高效特异性脱苦氨肽酶,实现对鳕鱼肽苦味的去除进而提升其附加值。【方法】本研究选取Aspergillus oryzae RIB40来源的氨肽酶AoAPase在毕赤酵母KM71中进行异源表达并探究其酶学性质;荧光探针法与电子舌技术联用评估AoAPase对鳕鱼肽的脱苦效果;高效液相色谱测定鳕鱼肽酶解液中游离氨基酸含量及分子量的分布变化;利用扫描电镜观察鳕鱼肽表面微观结构的差异性;通过评价DPPH、羟基及ABTS自由基清除能力,探究鳕鱼肽经AoAPase处理后抗氧化活性的变化。【结果】AoAPase在毕赤酵母KM71中成功异源表达,其分子量约41kDa。最适温度和pH分别为70℃和8.0,在最适条件下AoAPase酶活可达到2238U/mL,Ca²⁺能够提高其酶活;AoAPase具有底物特异性,以Leu-pNA为底物时,K_m为5.95mmol/L,V_max为43.58μmol/(mL·min);AoAPase通过切除鳕鱼肽段N端疏水性氨基酸残基和降低苦味显著的肽段(500‒1000 Da)含量,进而完全消除其苦味;经AoAPase处理后的鳕鱼肽粉质地更加细腻、松散,且抗氧化活性无明显差异。【结论】重组氨肽酶AoAPase能够特异性去除鳕鱼肽苦味且不影响其生物活性,本研究为AoAPase在蛋白脱苦中的应用奠定理论基础。     

一株嗜热聚对苯二甲酸乙二醇酯降解菌的分离及其降解特性解析北大核心

【目的】大量聚对苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene terephthalate,PET)塑料作为废弃物被丢弃,严重危害生态健康。针对嗜热PET降解菌缺乏这一情况,本研究旨在获得能够降解PET的嗜热菌,并阐述其降解机制。【方法】采集云南腾冲热泉中的废弃PET瓶,分析其表面生物膜的微生物群落多样性,从中筛选能够以PET为营养源生长的嗜热菌,并基于16S rRNA基因序列加以鉴定;以菌株的定殖能力与生长曲线为指标,优选出降解能力较强的降解菌,并测定其最适pH、温度和NaCl浓度;降解能力较强的降解菌分别作用于PET及PET中间体双(羟乙基)对苯二甲酸酯[bis(hydroxyethyl)terephthalate,BHET]和对苯二甲酸单(2-羟乙基)酯[mono(2-hydroxyethyl)terephthalate,MHET],测定产物生成量与降解率;通过观察PET膜表面微观结构、活菌数、酯酶活性等探究降解菌与PET的互作过程。【结果】废弃PET瓶表面生物膜中的微生物群落多样性低;从生物膜中筛选出5株能够以PET为营养源生长的嗜热菌;其中,菌株JQ3以PET为唯一碳源生长最佳,作为降解能力较强的降解菌,被鉴定为嗜热淀粉芽孢杆菌(Bacillus thermoamylovorans),其最适生长pH为7.0、最适生长温度为50℃、最适生长NaCl浓度为0.5%;菌株JQ3以0.043 mg PET/d的速率降解PET,对苯二甲酸(terephthalic acid,TPA)产量在第7天达到峰值45.2 mmol/L;菌株JQ3对PET中间体降解效率显著,6 h可降解85.9%的BHET,60 h可降解50.1%的MHET。菌株JQ3能够定殖于PET表面并形成生物膜,侵蚀PET并造成开裂和剥落。【结论】B.thermoamylovorans JQ3作为一株嗜热PET降解菌,能够高温(60℃)降解PET及其中间体,为实现PET的有效降解提供了新策略。