人清道夫受体AII胞外部分在毕赤酵母(Pichia pastoris)中的分泌表达

清道夫受体A (SR-A)介导巨噬细胞无限制摄取修饰的低密度脂蛋白 (Mldl)形成泡沫细胞 ,继而形成动脉粥样硬化病灶 ,在动脉粥样硬化的发生、发展过程中具有重要作用 ,被认为是治疗动脉粥样硬化的潜在靶点。本文应用RT PCR方法扩增得到编码人Ⅱ型SR A胞外部分 (shSR AII)的Cdna ,将其克隆至毕赤酵母 (Pichiapastoris)分泌表达载体Ppic9k构建重组表达质粒P9k shSR AII。将重组表达质粒线性化后 ,电转化毕赤酵母GS115 ,用原位双膜法筛选获得高表达shSR AII的重组菌株GS115 P9k shSR AII。重组菌株经 1%甲醇诱导 ,SDS PAGE、Westernblot分析表明shSR AII获得了分泌表达。Ligandbindingblot结果表明表达的shSR AII具有与配基oxLDL结合的生物活性。U937泡沫细胞模型进一步表明shSR AII可通过竞争性结合oxLDL来抑制泡沫细胞的形成 ,为以shSR AII为靶点建立抗动脉粥样硬化药物筛选模型奠定了基础.     

结核杆菌热休克蛋白70在毕赤酵母中的分泌表达与鉴定

获得结核杆菌热休克蛋白70在毕赤酵母中的分泌表达。构建了酵母表达质粒pPIC9K-hsp70,并将其线性化后用电穿孔法导入Pichia pastoris GS115,经PCR方法筛选出阳性菌落,在0.5%甲醇诱导下分泌表达。所得产物经离心收集上清、超滤浓缩脱盐、亲和层析后,分别用 SDSPAGE、Western blot和动物免疫实验对上清中的重组Hsp70进行鉴定,并考察产物对DC的作用。经SDSPAGE、Western blot分析表明表达的Hsp70表观分子量为70kD并能特异性地与抗Mt.Hsp70单抗结合,动物实验表明重组的Hsp70能在体诱导免疫应答。重组Hsp70能够诱导DC成熟并释放Th1型细胞因子。摇瓶发酵表达量达120mg/L,占培养上清30%以上。这为研究结核杆菌热休克蛋白70的生理功能提供了必要的物质条件。     

人纤溶酶原K1-3基因的克隆、表达和产物的纯化及抗癌活性分析

纤溶酶原K13功能区是近年发现的血管生成抑制因子,具有抑制肿瘤生长和转移的活性。以人血管生成抑制素cDNA为模板用PCR技术扩增了K13功能区的基因,DNA序列分析后克隆至质粒pPIC9K上获得重组质粒pPIC9K13,转化毕节酵母GS115,用PCR和G418法筛选高拷贝转化子,进行摇瓶发酵。SDSPAGE和Western blot分析结果证实K13基因已在GS115分泌表达,并具有免疫活性。选用30L和80L罐进行高密度发酵,甲醇诱导48h细胞密度达到OD250～300,比摇瓶提高5～6倍,表达量150200mg/L。发酵上清液经Streamline SP离子交换及PhenylSephorose疏水层析纯化,在SDSPAGE上显示一条带,纯度96%,动物实验证明纯化产物具有抗血管生成和抗肿瘤的活性。      

结核分枝杆菌ESAT-6蛋白在毕赤酵母中的融合表达及其活性研究

为了获得结核分枝杆菌ESAT 6蛋白在毕赤氏酵母中的高效表达 ,将人α-2a干扰素基因、结核分枝杆菌esat-6基因经PCR扩增并加上相应的酶切位点 ,两基因之间的DNA接头编码肠激酶识别的多肽 ,DNA经酶切连接插入分泌型载体pPIC9K ,将重组表达质粒pPIC9K-α2a-esat6用SalⅠ单酶切之后 ,电击转入PichiapastorisSMD1168中 ,采用G418梯度筛选获得高抗性转化子。以甲醇作为诱导物 ,发酵4d后取上清 ,进行SDS PAGE和Westernblot鉴定并分析表达产物的干扰素活性。结果表明 ,重组菌株成功地分泌表达了分子量大小约为 30kD的融合蛋白 ,表达产物不仅具有较高的干扰素活性 ,而且可以和结核病人血清发生特异性结合 ,为结核病的特异性诊断和结核病新型疫苗的研制打下了基础.     

猪瘟病毒E2基因在Pichia pastoris中的表达及其免疫活性的初步研究

将猪瘟病毒的E2基因克隆入酵母分泌型表达载体pPIC9K中,酶切线性化后电穿孔导入Pichia pastoris进行整合,经G418筛选得到高拷贝转化子,甲醇诱导表达。SDSPAGE和Western blot结果证实了酵母培养上清液中含有E2蛋白。免疫活性研究证明P. pastoris表达的E2蛋白能刺激动物产生抗猪瘟病毒的抗体。     

神经营养素-3基因的人工合成及其在毕赤酵母中的分泌性表达

根据人神经营养素3（Human neurotrohin3,hNT3）的基因序列,把编码氨基酸的密码子转换成毕赤酵母（Pichia pastoris）偏爱的形式,设计了10条36～59nt的寡聚核苷酸引物,通过5次连续PCR反应,获得了人工合成的NT3 cDNA片段（简称NT3b基因）。将合成的NT3b基因克隆到pPIC9K质粒上,获得重组表达载体pPIC9KNT3b。将重组表达载体pPIC9KNT3b和pPIC9KhNT3分别电击转化宿主毕赤酵母GS115菌株,经筛选得到重组转化子。不同转化子经甲醇诱导,表达产物进行SDSPAGE检测、Western blot检测和ELISA分析,结果表明,NT3b基因和hNT3基因成功获得分泌性表达,从整体水平上,使用偏爱密码子的NT3b基因在毕赤酵母GS115菌株中的表达明显优越于hNT3基因(x2=4.334,P<0.05),表达量在诱导后72～96h最高,达到31mg/L左右。     

抗对虾白斑综合症病毒单链抗体A1基因在酵母中表达及其与抗原结合活性

通过PCR从噬菌粒载体上扩增一种抗对虾白斑综合症病毒 (WSSV)的单链抗体A1(ScFvA1)基因 ,并构建于大肠杆菌 酵母穿梭质粒载体pPIC9K上。经PCR ,酶切 ,测序鉴定重组克隆 ,发现重组成功。将重组质粒pPIC9K ScF vA1转化毕赤酵母 (Pichiapastoris)GS115中 ,利用甲醇诱导 ,将单链抗体A1在酵母中进行了初步表达。经SDS PAGE电泳 ,发现其大小约为 32KD ,通过ELISA实验 ,证明表达上清液中的单链抗体具有很高的WSSV结合活性。     

猪白细胞介素_6在巴斯德毕氏酵母（Pichia pastoris）中的分泌表达

白细胞介素6（Interleukin_6, IL_6）是一种具有多种生物学效应的细胞因子,在疾病诊断与疫苗佐剂领域有广阔的应用前景。在本试验中,猪白细胞介素_6（pIL_6）的cDNA序列被克隆入甲醇酵母（Pichia pastoris）分泌表达载体pPIC9K中,并转化入P. pastoris GS115菌株。其重组菌株GS115/pPIC9K_IL6经1% 甲醇诱导后,能分泌表达分子量约为24.5KD的重组蛋白,Western blot确证为pIL_6。该酵母表达产物无N端糖基化修饰。用依赖IL6生长的B9细胞株检测提纯后的pIL_6,其生物学活性可达8×104IU/mg。     

扣囊复膜孢酵母β-葡萄糖苷酶基因在毕赤酵母中的克隆与表达

利用PCR技术,从扣囊复膜孢酵母的总DNA中扩增得到β-葡萄糖苷酶（β-Glucosidase）基因 (BGL1),长度为2596 bp,连接到pGEMT载体上,用限制性内切酶切下目的基因,插入到巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K中,使之位于α-因子信号肽下游,且与之同框, 构建成重组质粒pSHL9K。 通过电转化将重组质粒pSHL9K插入到Pichia pastoris GS115菌株染色体中,获得高效表达BGL1基因的毕赤酵母重组工程菌株。重组酶的最适温度为50℃,最适pH为5.4。培养基中β-葡萄糖苷酶活性最高可达47U/mL。     

细极链格孢菌peaT2基因在毕赤酵母中的表达及蛋白功能确定

从细极链格孢菌表达文库获得阳性克隆子,序列分析表明,克隆的DNA片段中含有完整的开放阅读框架,将该基因命名为peaT2(GenBank登录号为EF212880)。用PCR法扩增peaT2基因的编码序列并亚克隆到毕赤酵母表达系统的表达载体pPIC9K上,得到重组质粒pPIC9K/peaT2。重组质粒经SacⅠ线性化后用电穿孔法导入到毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中,采用MD、G418-YPD平板和PCR法筛选Mut+表型,获得了分泌表达的重组毕赤酵母。随机挑取一菌株作为表达菌,用甲醇诱导PeaT2蛋白表达。SDS-PAGE及Western blot检测结果均表明PeaT2在毕赤酵母中成功地分泌表达。用peaT2基因的表达蛋白处理小麦种子,生物测定表明,表达蛋白能明显促进小麦的生长,具有蛋白激发子作用。     

人可溶性白介素-4受体(sIL-4R)在甲醇酵母中的表达

白细胞介素-4(IL-4)作为一种多功能的细胞因子在哮喘等变态性炎症反应中具有关键作用。IL-4通过结合细胞表面的白介素-4受体(IL-4R)发挥其生物学效应。sIL-4R缺少跨膜和胞内结构域,结合IL-4后不能产生信号传递来介导IL-4的生物学活性,但sIL-4R与IL-4结合的高度特异性和极高的亲和力使它非常适合作为理想的IL-4拮抗剂应用于哮喘等疾病的治疗。采用RT-PCR方法以人的单核细胞总RNA为模板扩增得到编码sIL-4R的基因片段,经测序证实后插入到甲醇酵母分泌表达质粒pPIC9K中,得到重组质粒pPIC9K／sIL-4R,利用限制性内切酶BalⅡ将其线性化后用电穿孔法导入Pichia pastoris GS115。分别用SDS-PAGE、Western blot和Ligand bioding blot对重组菌发酵上清中的sIL-4R进行鉴定。结果表明,在分子量约为30kD处有sIL-4R特异条带出现,并具有结合其配基IL-4的生物学活性。     

人白介素2受体γ链胞外区在巴斯德毕赤酵母中的表达

目的:在毕赤酵母GS115中表达重组人白细胞介素2受体γ链(rhsIL-2Rγ)胞外区。方法:用RT-PCR法从正常人淋巴细胞中获得IL-2Rγ胞外区基因;构建重组质粒pPIC9K-hsIL-2Rγ,用聚乙二醇法转入感受态GS115菌株,MD平板筛选His+转化子,用BMMY培养基诱导表达rhsIL-2Rγ;对重组蛋白进行免疫酶染色、SDS-PAGE及Western印迹鉴定。结果:克隆到目的片段,构建了重组质粒pPIC9K-hsIL-2Rγ;免疫酶染色、Western印迹等结果显示,重组质粒已成功转化GS115,并获得诱导表达的rhsIL-2Rγ。结论:在毕赤酵母GS115中表达了rhsIL-2Rγ,其蛋白条带有上移现象,分子较大,可能其糖基化过度或存在二聚体。     

牛流行热病毒糖蛋白G1抗原表位在毕赤酵母中的表达和抗原性鉴定

从包含牛流行热病毒G蛋白基因的质粒pMD-G中克隆G1抗原表位区基因,亚克隆进表达载体pPIC9K,构建重组载体pPIC9K-G1,线性化后电转化毕赤酵母GS115,通过G418压力和PCR法筛选阳性重组酵母进行诱导表达。经SDS-PAGE、脱糖基化分析、Western blot、ELISA、兔体免疫实验和特异性分析,表明该基因在GS115中表达并进行了适度的糖基化,表达蛋白有良好的生物学活性和特异性,可作为包被抗原,开发ELISA诊断试剂盒。     

人血清白蛋白-血管钠肽融合蛋白在毕赤酵母中的表达

人工合成VNP基因,通过酶连构建HSA和VNP基因的融合基因,插入表达载体pPIC9K,电转至毕赤酵母GS115,构建成工程茵,甲醇诱导表达。重组表达质粒经双酶切验证构建正确;表达产物经SDS-PAGE分析分子量为69 000 Da,与理论值相符;Western blot鉴定产物兼有HSA和VNP免疫原性,说明其为杂合分子;兔胸主动脉环离体灌流实验证明融合蛋白具有舒张血管活性。本研究说明毕赤酵母适于HSA-VNP融合蛋白的表达,为进一步开发稳定的VNP药物提供了生物制备方法。     

破伤风毒素保护性抗原在毕氏酵母中的分泌表达

采用PCR方法．从C.Tetani 64008菌株中扩增大小为1353bp的破伤风毒素与靶细胞起结合作用的重链C端基因(Tetc),直接连接pGEM-T栽体进行测序,并以pPIC9K为表达栽体构建重组表达质粒,经线形化的重组质粒电转化毕氏酵母细胞GS1l5和KM71．甲醇诱导获得了分泌表达,表达产物存在于培养上清中,占分泌蛋白的10％,通过免疫印迹可以检测到重组表达产物,活性测定表明,重组蛋白具特异结合活性,本研究通过实现破伤风毒素保护性抗原在酵母系统中的分泌表达、研究其影响因素,为其它细菌毒素蛋白高效可溶性表达,及进一步抗原片段介导保护性免疫研究及抗毒素制备奠定了基础。     

人胸腺素α1基因在毕赤酵母中的融合表达

根据已知人胸腺素1（human Thymosin α1,hTα1）的氨基酸序列和毕赤酵母偏爱密码子,人工合成了hTα1基因。用合成的hTα1基因取代核糖体蛋白（ribosomal protein,RP）基因5′端的84个碱基,组成重组基因hTα1-RP,连接到质粒pPIC3.5K上,构建表达质粒pPIC3.5K/hTα1-RP。表达质粒用电激法转化到毕赤酵母GS115菌株中。甲醇诱导表达融合蛋白,SDS-PAGE和Western印迹结果证明,重组基因hTα1-RP在酵母中得到了表达,表达量约为25mg/L。 Construction and Expression of Recombinant Human Thymosin α1 Fusion Gene in Pichia pastoris HUANG Wen,LI Zhao-yu,JIN Li-ji,AN Li-jia Abstract:The human Thymosin α1 (hTα1) gene was synthesized according to the optimal codons of Pichia pastoris and was fused in 5' terminal of ribosomal protein (RP) gene using over lapping polymerase chain reaction.The fusion gene was inserted into expression vector of pPIC3.5K and was transformed into HIS4 mutant strain GS115 by electroporation.Both SDS-PAGE and Western blot indicated that this fusion protein was expressed.The expression level was about 25mg/L. Key words：human Thymosin α1; fusion protein; Pichia pastoris     

Protein expression and purification of human Zbtb7A in Pichia pastoris via gene codon optimization and synthesis

Human Zbtb7A was proved to be an important molecular switch in oncogenesis. However, it is difficult to obtain its protein expression in prokaryotic system, due to high G+C content and rare codons in zbtb7a gene. Therefore, to further research the function and application of this protein, we optimized its coding sequence according to the codon bias of Pichia pastoris, synthesized the sequence with two-step PCR and confirmed the accuracy by DNA sequencing. The assembled fragment was introduced into P. pastoris expression vector pPIC9K and the resultant plasmid pPIC9K-zbtb7a-his(6) was transformed into the P. pastoris strain GS115 by electroporation. The products of the transformants induced by methanol were analyzed by 10% SDS-PAGE and identified by Western Blot assay. The expression conditions of the selected transformant were optimized. Additionally, a two-step purification protocol was applied to purify the recombinant protein. The results showed that the synthetic coding sequence of human Zbtb7A was successfully obtained and inserted into pPIC9K vector. Human Zbtb7A protein was expressed in P. pastoris and identified by western blot. The optimal conditions for its expression in P. pastoris were under a final concentration of 1% methanol and a time-course of 4d. Through the two-step purification, Zbtb7A protein was purified in high purity and its production reached up to as high as 18 mg/L. These results indicated that an effective procedure for expressing and purifying human Zbtb7A in P. pastoris was established.     

mMR-1基因的克隆和在毕赤酵母中分泌表达

hMR-1为本实验室首次克隆发现的一个人类新基因 ,是一种和三种肌肉收缩蛋白及多种细胞信号蛋白具有相互作用的膜蛋白。经与鼠基因组数据库进行同源分析后设计合成引物 ,利用RT-PCR技术从小鼠C57BL 6J脾脏T淋巴细胞总RNA中反转录得到鼠源MR-1基因 (mMR-1) ,提交GenBank ,收录号 (AY2 99972 )。序列分析证明其与人源MR-1基因 (hMR-1)同源性为 90.1%。构建表达载体pPIC9 mMR-1电转化PichiapastorisGS115 ,筛选得到整合分泌表达mMR-1蛋白的重组酵母菌株。表达目的蛋白分子量 25kD ,诱导 5d时产量达到 50mg/L ,通过Westernblot验证了表达产物的正确性。本研究为进一步研究新基因MR-1的生物学功能奠定了基础。     

番茄脂氧合酶基因的表达和酶活性分析

将番茄脂氧合酶基因Tom loxD克隆至酵母表达载体pPIC9K中,转化毕赤酵母GS115菌株,构建组成型表达Tom loxD的酵母工程菌株。SDS-PAGE和W estern blot分析表明,经甲醇诱导,Tom loxD蛋白在酵母中得到表达,表达的融合蛋白分子量约为103.56 kD,与预测的分子量一致。酶活性分析表明,酵母中表达的Tom loxD蛋白具有脂氧合酶活性。半定量RT-PCR分析表明,Tom loxD基因在番茄中表达受机械损伤的诱导,损伤处理的番茄叶片中脂氧合酶的活性明显增高。说明Tom loxD基因在番茄防御信号中发挥作用。