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一种多拷贝毕赤酵母表达载体的构建及人脑源性神经营养因子的表达 总被引:5,自引:0,他引:5
利用PCR技术扩增出pPIC9K载体的HIS4 Kan序列片段 ,与pPICZα重组 ,构建结合了两个载体特点的适合体外构建多拷贝基因表达盒的毕赤酵母表达载体pPICZα1,改造后的载体含HIS4 Kan序列 ,能整合到酵母染色体上 ,具有筛选方便、外源基因多拷贝组建迅速、蛋白产物分泌表达和易纯化等优点。将人脑源性神经营养因子(hBDNF)的cDNA(35 7bp)克隆入载体pPICZα1,利用同尾酶BglⅡ、BamHⅠ不可逆连接方式 ,分别构建含有 1、2、3、6个拷贝hBDNF表达盒的重组表达载体 ,电击法转化毕赤酵母GS115菌株 ,用G4 18和Zeocin筛选转化子 ,筛选到的阳性转化子用 0 5 %甲醇诱导 ,获得分泌型表达。表达产物类似于天然神经营养因子单体大小、分子量约 14kD。多拷贝hBDNF表达盒的表达水平亦高于单拷贝hBDNF表达盒 ,ELISA和Westernblot检测表明 :表达的蛋白能与鸡抗人脑源性神经营养因子抗体特异结合 ,证实该表达蛋白具有hBDNF的免疫原性 相似文献
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酵母pac—1基因的克隆、序列分析和在大肠杆菌中的高效表达及活性测定 总被引:4,自引:0,他引:4
粟酒裂殖酵母菌 (Schizosaccharmycespombe)的 pac 1基因于 1991年Yuichilino等首次报道。在温度敏感型的酵母突变体中 ,pac 1基因是一个多拷贝阻遏子 ,它使酵母在限制温度培养条件下的减数分裂不受调控 ,对酵母的生长过程起着重要的调节作用。该基因有一个编码 36 4个氨基酸的开放阅读框 ,编码产物的羧基端与大肠杆菌核糖核酸酶Ⅲ有2 5 %的同源性。通过酶活性测定 ,已经确定它是一类依赖dsRNA的核糖核酸酶 ,具有降解dsRNA的功能[1,2 ] 。由于大多数植物病毒为RNA病毒 ,因此无论它的基… 相似文献
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Vogt从粗的Aspergillus oryzae α-淀粉酶制剂提纯了单链特异的核酸酶S_1(简称S_1酶),并详细描述了它的性质。目前已广泛利用这种酶于植物病毒和类病毒(RNA)的互补DNA(cDNA)的分子杂交中。本文报道从商品高峰淀粉酶粉制剂提取核酸酶S_1及其在cDNA杂交中的应用。 相似文献
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特异切割马铃薯纺锤形块茎类病毒负链的多价核酶的构建和体外活性测定 总被引:4,自引:0,他引:4
根据锤头型核酶的作用模式 ,设计、合成并克隆了特异切割马铃薯纺锤形块茎类病毒 (PSTVd)负链RNA不同区域位点的双价和三价锤头型核酶基因。通过体外转录 ,将PSTVd负链RNA分别与双价和三价核酶混合 ,37℃温育 2h。结果表明 ,双价核酶和三价核酶均表现出较高的切割活性 ,其中双价核酶处理的切割产物的大小与理论值相符合。三价核酶虽表现出较高的切割活性 ,但只是其中一价核酶在起作用。讨论了二价和三价核酶的应用前景。 相似文献
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玉米粗缩病毒基因组第七组份的cDNA克隆及序列分析 总被引:5,自引:0,他引:5
从采自中国河北滦城感病的玉米材料中提取玉米粗缩病毒(MRDV)的双链RNA。根据已知MRDV的部分序列设计引物,反转录、PCR扩增,克隆并测序分析了MRDV的第七片段(S7)cDNA序列。结果表明,S7 cDNA序列全长为1936bp,与国外所测的MRDV S7的序列长度相等,而且S7包含的两个阅读框(ORF1和ORF2)位置无变化。它们的核苷酸和最大开放阅读框(ORF1)同源性分别为877%和91.6%,然而,MRDV S7的片段与水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)S8片段的核苷酸和最大开放阅读框(ORF1)有更高的同源性,分别为95.5%和93.5%。 相似文献
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神经营养素-3基因的人工合成及其在毕赤酵母中的分泌性表达 总被引:3,自引:0,他引:3
根据人神经营养素3(Human neurotrohin3,hNT3)的基因序列,把编码氨基酸的密码子转换成毕赤酵母(Pichia pastoris)偏爱的形式,设计了10条36~59nt的寡聚核苷酸引物,通过5次连续PCR反应,获得了人工合成的NT3 cDNA片段(简称NT3b基因)。将合成的NT3b基因克隆到pPIC9K质粒上,获得重组表达载体pPIC9KNT3b。将重组表达载体pPIC9KNT3b和pPIC9KhNT3分别电击转化宿主毕赤酵母GS115菌株,经筛选得到重组转化子。不同转化子经甲醇诱导,表达产物进行SDSPAGE检测、Western blot检测和ELISA分析,结果表明,NT3b基因和hNT3基因成功获得分泌性表达,从整体水平上,使用偏爱密码子的NT3b基因在毕赤酵母GS115菌株中的表达明显优越于hNT3基因(x2=4.334,P<0.05),表达量在诱导后72~96h最高,达到31mg/L左右。 相似文献