pemt2-cDNA的转染抑制大鼠CBRH-7919肝癌细胞c-Met及Bcl-2的表达并诱发凋亡

为探讨磷脂酰乙醇胺 N 甲基转移酶 2 (phosphatidylethanolamine N methyltransferase 2 ,PEMT2 )的转染抑制大鼠肝癌CBRH 7919细胞增殖的分子机理 ,构建了带有完整的pemt2 cDNA基因质粒载体 ,经转染和鉴定 ,确知其在大鼠肝癌细胞系CBRH 7919细胞中稳定高表达 .用细胞培养、免疫细胞化学、Western印迹、流式细胞仪和琼脂糖凝胶电泳等技术研究c Met(HGF的受体 )及抗凋亡蛋白Bcl 2在此过程中的表达和是否诱发凋亡 .免疫组织化学及Western印迹分析显示在转染高表达细胞中 ,c Met及Bcl 2的表达下调 .流式细胞仪分析表明 ,在转染pemt2 cDNA的高表达细胞中 ,G1期细胞增加 ,S期细胞减少 ,并在G0 期出现一个凋亡峰 .琼脂糖凝胶电泳谱显示梯状条带 .结果表明 :pemt2的转染可使大鼠肝癌细胞的c Met及Bcl 2的表达下调 ,并发生凋亡 .     

pLNCX-pemt2重组载体的构建及pemt2基因在大鼠肝癌CBRH-7919细胞中的表达

为进一步研究 pemt2对肝癌细胞生长抑制的作用机制提供方便的实验模型 ,构建了p LNCX- pemt2重组体 .将目的基因 pemt2连接入含有 neo抗性基因的真核细胞表达载体 p LNCX中 ,构建 p LNCX- pemt2重组子 ,并用磷酸钙沉淀法将其转入大鼠肝癌 CBRH- 791 9细胞中 ,应用PCR、Western印迹及 [3 H]SAM参入等技术对其转染、表达及活性进行鉴定 .转染 p LNCX- pemt2的大鼠肝癌细胞 ,PEMT2成功表达 (分子量为 2 2 .5k D) ;高表达克隆 PEMT2的表达量比对照组高约 5倍 ,其活性比对照组高 2 .1倍 ;细胞生长的倍增时间从 2 1 .54± 7.0 8h延长到 43.2 2± 7.1 1h.结果表明 ,p LNCX- pemt2重组体转入肝癌细胞后 ,PEMT2蛋白得到高效表达 ,明显抑制肝癌细胞生长 .     

pLNCX-pemt2重组载体的构建ptpemt2基因在大鼠肝癌CBRH-7919细胞中的表达

为进一步研究pemt2对肝癌细胞生长抑制的作用机制提供方便的实验模型,构建了pLNCX-pemt2重组体.将目的基因pemt2连接入含有neo抗性基因的真核细胞表达载体pLNCX中,构建pLNCX-pemt2重组子,并用磷酸钙沉淀法将其转入大鼠肝癌CBRH-7919细胞中,应用PCR、Western印迹及[3H]SAM参入等技术对其转染、表达及活性进行鉴定.转染pLNCX-pemt2的大鼠肝癌细胞,PEMT2成功表达(分子量为22.5kD);高表达克隆PEMT2的表达量对照组高约5倍,其活性比对照组高2.1倍;细胞生长的倍增时间从21.54±7.08h延长到43.22±7.11h.结果表明,pLNCX-pemt2重组体转入肝癌细胞后,PEMT2蛋白得到高效表达,明显抑制肝癌细胞生长.     

人胸腺素α1基因在毕赤酵母中的融合表达

根据已知人胸腺素1（human Thymosin α1,hTα1）的氨基酸序列和毕赤酵母偏爱密码子,人工合成了hTα1基因。用合成的hTα1基因取代核糖体蛋白（ribosomal protein,RP）基因5′端的84个碱基,组成重组基因hTα1-RP,连接到质粒pPIC3.5K上,构建表达质粒pPIC3.5K/hTα1-RP。表达质粒用电激法转化到毕赤酵母GS115菌株中。甲醇诱导表达融合蛋白,SDS-PAGE和Western印迹结果证明,重组基因hTα1-RP在酵母中得到了表达,表达量约为25mg/L。 Construction and Expression of Recombinant Human Thymosin α1 Fusion Gene in Pichia pastoris HUANG Wen,LI Zhao-yu,JIN Li-ji,AN Li-jia Abstract:The human Thymosin α1 (hTα1) gene was synthesized according to the optimal codons of Pichia pastoris and was fused in 5' terminal of ribosomal protein (RP) gene using over lapping polymerase chain reaction.The fusion gene was inserted into expression vector of pPIC3.5K and was transformed into HIS4 mutant strain GS115 by electroporation.Both SDS-PAGE and Western blot indicated that this fusion protein was expressed.The expression level was about 25mg/L. Key words：human Thymosin α1; fusion protein; Pichia pastoris     

pLNCX-pemt2重组载体的构建及pemt2基因在大鼠肝癌CBRH-7919细胞中的表达

为进一步研究 pemt2对肝癌细胞生长抑制的作用机制提供方便的实验模型 ,构建了p LNCX- pemt2重组体 .将目的基因 pemt2连接入含有 neo抗性基因的真核细胞表达载体 p LNCX中 ,构建 p LNCX- pemt2重组子 ,并用磷酸钙沉淀法将其转入大鼠肝癌 CBRH- 791 9细胞中 ,应用PCR、Western印迹及 [3 H]SAM参入等技术对其转染、表达及活性进行鉴定 .转染 p LNCX- pemt2的大鼠肝癌细胞 ,PEMT2成功表达 (分子量为 2 2 .5k D) ;高表达克隆 PEMT2的表达量比对照组高约 5倍 ,其活性比对照组高 2 .1倍 ;细胞生长的倍增时间从 2 1 .54± 7.0 8h延长到 43.2 2± 7.1 1h.结果表明 ,p LNCX- pemt2重组体转入肝癌细胞后 ,PEMT2蛋白得到高效表达 ,明显抑制肝癌细胞生长 .     

Ras-GTP-Raf复合物及其信号传导的分子机制

Ras-GTP-Raf复合物是RTKs介导的Ras通路的一个关键环节,在Ras-GTP-Raf复合物中信号传递的分子机制是Ras-GTP-Raf复合物作为一个整体开关信号传导、启动信号放大级联反应及可能导致肿瘤发生.此外,PKC介导的Raf的激活也必需有Ras-GTP-Raf复合物的存在.