日本血吸虫新抗原基因Sj—Ts4的克隆、表达及免疫保护性

为探讨旋毛虫感染小鼠后抗血吸虫感染的分子机制 ,并为血吸虫病疫苗的研究提供新的抗原分子 ,用旋毛虫感染鼠血清筛选日本血吸虫成虫cDNA文库。经过 3轮筛选 ,获得 9个阳性克隆 ,其中新基因Sj Ts4有一完整的编码框 ,编码2 10个氨基酸。该蛋白质的理论分子量为 2 3kD ,等电点为 7.72。将Sj Ts4亚克隆于原核表达载体 pGEX 5X 3,以GST融合蛋白的形式在E .coliDH5α中表达。Western印迹分析显示 ,重组Sj Ts4蛋白 (rSj Ts4)能被慢性感染鼠血清识别。rSj Ts4或与弗氏完全佐剂混合后免疫小鼠 ,均可以诱导产生特异性的IgG抗体 ,抗体效价可高达 1∶2 5 6 0 0。两免疫组的减虫率分别为31.36 %和 36 .80 % ,与对照组相比都具有统计学意义     

家蝇卵黄蛋白基因的克隆与结构序列分析

家蝇卵黄蛋白基因编码的卵黄蛋白是家蝇胚胎发育的重要营养来源 .根据 3种家蝇卵黄蛋白cDNA保守序列设计引物 ,用PCR技术从家蝇基因组DNA中扩增到大小为 76 8bp的mdYP1基因的部分DNA片段 .经地高辛标记成特异性探针 ,从构建的家蝇基因组文库中筛选出一个阳性克隆 ,并从该克隆中分离到大小为 3991bp的mdYP1基因组基因 .序列分析显示 ,该基因组序列含有约1 6kb的 5′ 上游区和 1 0kb的 3′ 下游区 ,编码区由一个 6 1bp的内含子和大小分别为 2 2 2bp和10 2 8bp的 2个外显子组成 .5′ 上游区含有典型的CAAT TATA盒 .     

温敏核不育水稻5460S细菌人工染色体文库的构建和鉴定

为了构建温敏核不育 (TGMS)基因区域的精细物理图谱并最终分离TGMS基因 ,以温敏核不育水稻 5 46 0S为材料 ,摸索优化了构建植物细菌人工染色体 (BAC)文库的方法 ,构建了一个高质量的BAC文库 .该文库由 1 95 84个克隆构成 ,插入片段平均长度为 1 1 0kb ,相当于水稻单倍体基因组大小的 5倍 ;以分子量分别为 1 40和2 5 0kb的 2个大BAC克隆进行稳定性传代实验 ,经 1 0 0代传代后其插入的DNA片段仍然稳定存在 ;以线粒体和叶绿体基因为探针筛选BAC文库 ,未检验出叶绿体和线粒体DNA的污染 ;以和tms1基因连锁的 3个分子标记作为探针对BAC文库进行了筛选 ,每个探针至少可获得一个阳性克隆 ,利用热不对称性交错PCR(Tail PCR)法成功分离了阳性克隆的左右末端序列 .     

用改良消减杂交结合选择性PCR法构建老年性白内障消减cDNA文库

为构建含较多大片段的高质量的老年性白内障消减cDNA文库 ,利用生物素标记、磁珠分离的改良消减杂交法获得差异cDNA .利用选择性PCR法扩增其中大片段差异cDNA ,将其与T 载体进行T A连接并转化入大肠杆菌 ,成功构建老年性白内障消减cDNA文库 .共获得 4 0 0 0余个克隆 ,随机挑取的 2 2个克隆中 ,≥ 10 0 0bp的片段有 7个 ,占 31 8% ,≥ 75 0bp有 15个 ,占 6 8 2 % .将≥ 75 0bp的 15个克隆进行反向点杂交 ,排除其中假阳性克隆 ,阳性克隆经测序并与GenBank比较 ,得到 6个已知基因、1个新基因 ,6个已知基因中 4个为全长基因 ,说明所得cDNA片段较大 ,文库质量较高 .改良消减杂交法结合选择性PCR法可以快速有效地获得大片段高质量的消减cDNA文库 ,为进一步筛选、鉴定老年性白内障致病相关基因奠定了基础     

用抗细胞表面分子单链抗体筛选和鉴别其相互作用肽

展示于噬茵体表面的肽库适于用抗体筛选其特异性结合表达肽。scFv-C193是一个抗KGla细胞表面分子的单链抗体,其抗原仍不清楚,为了筛选并鉴定其识别分子,用8cFv-C193筛选了1个展示于T7噬茵体表面的人胎肝cDNA片段库。经4轮生物吸附后分离单个阳性噬斑,并对其表达产物做电泳分析及斑点杂交。结果鉴别出1个scFv-C193结合肽,scFv-C193+克隆噬菌体DNA插入片段的PCR扩增和序列分析结果表明它是1个43bpDNA片段表达产物。BLAST分析EST人类基因数据库,发现它97％相同于CD34₊造血干/祖细胞mRNA的1-43bp,提示scFv-C193识别片段存在于人类造血干／祖细胞基因中,单克隆单链抗体scFv-C193可能用于研究这些人类基因的性质。     

麦迪霉素产生菌酮基还原酶基因的研究

将麦迪霉素产生菌基因文库中与放线紫红索酮基还原酶基因actⅢ有同源性的4·0kb DNA片段克隆到质粒载体pWHM3中,构成重组质粒pCB4。将质粒pCB4转入酮基还原酶基因缺陷菌株——加利利链霉菌ATCC3167l中,得到转化子。转化子发酵产物经TLC和HPLC分析证明是阿克拉菌酮,与加利利链霉菌原株ATCC31133的产物相同,说明麦迪霉素产生菌酮基还原酶基因互补了加利利链霉菌ATCC31671中缺陷的酮基还原酶基因,使其恢复了产生阿克拉菌酮的能力。4．Okb DNA片段插入方向相反的重组质粒pCBR4在加利利链霉菌ATCC31671中发酵产物经TLC分析证明也是阿克拉菌酮,这说明4．0kbDNA片段中麦迪霉素产生菌酮基还原酶基因具有自身的启动子。对4．0kb DNA片段进行了限制酶酶切分析,建立了其酶切图谱。以actⅢ基因为探针,经分子杂交以及亚克隆和DNA转化实验,将麦迪霉索产生菌酮基还原酶基因定位于BssH Ⅱ—BamH Ⅰ 1．3kb DNA片段上。对1．3kb DNA片段核苷酸序列分析结果表明：此1．3kbDNA片段中含有一个独立的ORF,起始密码ATG,终止密码TAG,含783bp;在起始密码上游有GGAGG5个核苷酸SD序列;此ORF编码260个氨基酸,与actⅢ基因编码的261个氨基酸相似性为77．4%,相同性为66．7％,对麦迪霉素产生苗酮基还原酶基因的可能作用进行了讨论。     

马铃薯块茎组织特异性启动子的克隆及序列分析

利用PCR技术从马铃薯陇薯3号基因组DNA中扩增出长度约为1.0 kb的DNA片段,经与T载体连接,测序表明,克隆到的DNA片段大小为969 bp,该序列与GenBank中已公布的patatin启动子序列同源性为97.94％;采用植物顺式调控元件数据库PLACE和PlantCare进行序列分析,结果表明,该片段含有启动子的保守序列TATA-box和CAAT-box,且在CAAT-box上游有8 bp的增强子.此外,还具有马铃薯块茎蛋白patatin基因启动子保守调控序列的蔗糖效应元件(SURE)4个及马铃薯储藏物特异结合调控patatin蛋白表达位点(B-box)2个,而这些特异序列可能是基因特异表达所必须的.     

用改良消减杂交筛选类风湿性关节炎滑膜细胞中高表达基因

 为了研究类风湿性关节炎 (rheumatoid arthritis,RA)滑膜细胞 (fibroblast- like synovialcells,FLS)过度增殖和破坏软骨的分子机理 ,利用改良消减杂交法以骨性关节炎 (osteoarthritis,OA)病人滑膜细胞为对照 ,筛选 RA滑膜细胞中的高表达基因 .将得到的基因片段克隆入质粒载体 ,通过反向点杂交排除假阳性克隆后 ,将阳性克隆进行核酸序列分析 ,最后用 Northern杂交方法检测一些高表达基因在 RA和 OA病人滑膜细胞中的表达水平 .结果显示 ,共分离到 1 50个 RA高表达基因片段 ,其中长于 1 0 0 0 bp的片段占 8% (1 2 /1 50 ) ,长于 40 0 bp的片段占 36.7% (55/1 50 ) ,在大于 40 0 bp的片段中 ,假阳性率为 2 3.7% (1 3/55) .在测序的 1 8个片段中 ,已知基因有 1 2个 ,其中包括 IGF- 1结合蛋白 (IGFBP)特异性丝氨酸蛋白酶、层粘连蛋白受体和组织蛋白酶 B等 .新序列有 6个 ,其中两个序列分别与 Ring- box蛋白 1和 SON DNA结合蛋白同源 .对 IGFBP特异性丝氨酸蛋白酶、层粘连蛋白受体和组织蛋白酶 B基因的 Northern杂交分析显示 ,在 RA病人滑膜细胞中 ,这些基因的表达水平高于 OA病人滑膜细胞 .这些结果提示 ,这种改良消减杂交法是一种简便有效的分离差异表达基因的方法 ;IGF- 1结合蛋白特异性丝氨酸蛋白酶、层粘     

在Yunnanese(Aγδβ)~0-地贫3′缺失端点下游鉴别到两个增强子样顺序

利用荧光酶报告基因系统搜索了Yunnanese (Aγδβ) 0 地中海贫血缺失 3′端点下游 11 5kb区域内的调控顺序 .确定缺失 3′端点立即下游区 1 7kb片段 ,在人红白血病细胞K5 6 2及鼠红白血病细胞MELGM979中 ,可使γ 珠蛋白基因启动子驱动的荧光酶基因表达增加 3 8～ 4 0倍 ,而在HeLa细胞中仅增加 1 5倍 .位于缺失 3′端点约 10kb的一个长 1 4kb片段在K5 6 2和MELGM979中 ,可使γ 基因启动子驱动的荧光酶基因表达增加 2 4～2 9倍 ,而在HeLa细胞中无增加 .结果说明这两段顺序均有增强子活性 ,并且这种活性具有一定的红细胞特异性 .进一步证明 1 7kb片段内包含多个转录调节蛋白结合模体的 430bp片段包含了 1 7kb片段的大部分增强子活性 .这些结果为缺失导致增强子样顺序并入到接近Gγ 基因 ,是Yunnanese (Aγδβ) 0 地贫缺失突变体中胎儿Gγ 珠蛋白基因 ,在成人期持续活跃表达原因的假设提供了实验证据 .     

干旱胁迫下黄檗幼苗cDNA消减文库的构建和分析

以干旱胁迫下的黄檗幼苗cDNA 为tester, 正常生长的黄檗幼苗cDNA为driver, 利用抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridization, SSH)构建了干旱胁迫下黄檗幼苗的消减文库并对其进行了EST序列分析。从消减文库中随机挑取20个阳性克隆, 提取质粒进行酶切和PCR鉴定, 显示文库克隆的重组率大于95%, 插入片段大小大部分集中在300~800bp之间。随机挑取816个克隆进行测序, 得到265个基因。将其进行同源性分析, 划分为16类。获得了热激蛋白70、脱水响应蛋白(RD22)、通用胁迫蛋白、金属硫蛋白(MTII), 晚期胚胎丰富蛋白(LEA14)等44种与干旱胁迫相关的基因,它们涉及了植物的渗透调节、信号传递、转录调控、活性氧清除等方面。本研究为抗逆基因克隆和系统研究干旱胁迫下黄檗基因的表达奠定了重要的理论基础。     

用λ－ZAPⅡ作载体构建豌豆卷须cDNA文库

用改进的异硫氰酸胍－苯酚－氯仿抽提法提取了豌豆卷须总ＲＮＡ并纯化了ｍＲＮＡ,合成双链ｃＤＮＡ后加上人工接头,Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ２Ｂ柱层析去掉小片段,最后连入载体λ－ＺＡＰⅡ并用噬菌体包装蛋白进行体外包装,经稀释测定出含有重组子的文库大小为９．２×１０~５．原位杂交筛选出了肌动蛋白阳性克隆。     

Construction and characterization of normalized cDNA library of maize inbred Mo17 from multiple tissues and developmental stages

Comprehensive complementary DNA (cDNA) library is a valuable resource for functional genomics. In this study, we set up a normalized cDNA library of Mo17 (MONL) by saturation hybridization with genomic DNA, which contained expressed genes of eight tissues and organs from inbred Mo17 of maize (Zea mays L.). In this library, the insert sizes range from 0.4 kb to 4 kb and the average size is 1.18 kb. 10.830 clones were spotted on nylon membrane to make a cDNA microarray. Randomly picked 300 clones from the cDNA library were sequenced. The cDNA microarry was hybridized with pooled tissue mRNA probes or housekeeping gene cDNA probes. The results showed the normalized cDNA library comprehensively includes tissue-specific genes in which 71% are unique ESTs (expressed sequence tags) based on the 300 sequences analyzed. Using BLAST program to compare the sequences against online nucleotide databases, 88% sequences were found in ZmDB or NCBI, and 12% sequences were not found in existing nucleotide databases. More than 73% sequences are of unknown function. The library could be extensively used in developing DNA markers, sequencing ESTs, mining new genes, identifying positional cloning and candidate gene, and developing microarrays in maize genomics research.     

肝细胞癌高表达基因cDNA文库的构建及生物信息学分析

目的:构建肝细胞癌的高表达基因cDNA文库并进行相应的生物信息学分析。方法:应用抑制性消减杂交(SSH)技术,以7对肝癌组织和癌旁组织为实验材料,构建肝癌高表达基因的cDNA文库;使用BioEdit、BLAST和EGAD等软件进行生物信息学分析。结果:获得1450个白色阳性克隆,经PCR扩增后均有100～1000bb的插入片段,经杂交验证选取125个克隆进行测序;经BLAST、EGAD等生物信息学工具分析获得基因83个,其中细胞分裂相关基因5个,参与细胞信号转导或通讯的基因5个,参与细胞结构或运动的基因7个,细胞或器官防御相关基因11个,参与细胞内基因转录或蛋白表达的基因22个,代谢相关基因18个,另有15个未归类基因。结论:利用SSH技术可构建肝细胞癌组织差异表达基因的消减cDNA文库,为进一步深入探讨肝癌的诊断、治疗和预后评估等提供更多的分子指标。     

一种快速简便构建DNA病毒测序文库的方法

为了对1株中国棉铃虫核型多角体缺失病毒HZ-9进行基因组测序,采用了一种新的方法,通过超声波振断HaBacHZ9细菌人工染色体质粒（bacterial artificial chromosome plasmid,Bacmid）基因组DNA,用Taq酶在DNA片段两端加腺噤呤A,胶回收后得到预期的1—2kb的DNA片段,然后与pGEM-Teasy载体连接,构建了中国棉铃虫缺失病毒HaBacHZ9的亚克隆文库。结果随机挑选10个克隆子酶切分析,显示9个克隆子有1500bp左右的插入片断,并对HaBaeHZ9进行了全基因组测序。结论成功构建了HaBaeHZ9的DNA测序文库,为HZ-9功能基因组学研究奠定了基础,这是一种简单快速的构建DNA病毒测序文库的方法。     

特异结合人禽流感病毒H5N1的scFv分子性能鉴定

目的从人源化噬菌体抗体库（human single fold scFv libraries I＋J）中筛选到能高亲和性、特异结合人禽流感病毒H5N1的单链抗体,为建立H5N1快速筛查试剂和人源化治疗单抗奠定基础。方法以H5N1病毒的血凝素（hemagglutitin,HA）蛋白和核蛋白（nucleoprotein,NP）为目的蛋白,对上述单抗噬菌体文库以亲和性为原理进行筛选,经过3轮筛选富集后,随机挑选了96个噬菌体克隆扩增培养,ELISA法挑选能特异性、高亲和性结合目的蛋白的噬菌体克隆,并换用HB2151宿主菌对阳性单链抗体克隆进行可溶性表达,ELISA法鉴定可溶性单链抗体的结合活性,PCR扩增阳性克隆的轻、重链基因片段,并对阳性单链抗体分子测序和序列分析。结果经过3轮筛选,分别从96个噬菌体克隆中挑选到了两株能特异结合NP蛋白、3株能特异结合HA蛋白的单链抗体,PCR扩增都得到了长为300、302和935bp的轻链、重链和轻链-连接片段-重链的基因片段,测序结果分析发现上述5条单链抗体片段在轻链的47、49、50、51、53、54、56、96、97、98和99位的氨基酸组成不同,而特异结合NP蛋白的单链在重链区域氨基酸组成完全相同,而特异结合HA蛋白的单链在重链的44、47、85、86、87、88和89位氨基酸组成不同。结论从噬菌体抗体库中筛选到的特异结合HA和NP蛋白的单链抗体片段,可为进一步研发H5N1快速筛选试剂和人源性治疗抗体奠定基础,也可为鉴定HA和NP蛋白中的抗原决定簇提供结构信息。     

山羊瘤胃微生物宏基因组BAC文库的构建与分析

从山羊瘤胃液中提取混合微生物DNA,经BamHI部分酶切得到50kb～800kb的DNA片段后,将其连接到pCCIBAC载体上,转化E．coliEPI300,建立山羊瘤胃微生物BAC文库。经RFLP鉴定分析,该文库12672个克隆,平均插入片段为6lkb。该文库的构建为后续新型基因的筛选提供了材料,为进一步研究山羊瘤胃微生物奠定了基础。     

Construction and characterization of normalized cDNA library of maize inbred MO17 from multiple tissues and developmental stages

A comprehensive complementary DNA (cDNA) library is a valuable resource for functional genomics. In this study, we set up a normalized cDNA library of Mo17 (MONL) by saturation hybridization with genomic DNA, which contained expressed genes of eight tissues and organs from inbred Mo17 of maize (Zea mays L.). In this library, the insert sizes range from 0.4 kb to 4 kb and the average size is 1.18 kb. 10 830 clones were spotted on nylon membrane to make a cDNA microarray. Randomly picked 300 clones from the cDNA library were sequenced. The cDNA microarray was hybridized with pooled tissue mRNA probes or housekeeping gene cDNA probes. The results showed the normalized cDNA library comprehensively includes tissue-specific genes in which 71% are unique ESTs (expressed sequence tags) based on the 300 sequences analyzed. Using the BLAST program to compare the sequences against online nucleotide databases, 88% sequences were found in ZmDB or NCBI, and 12% sequences were not found in existing nucleotide databases. More than 73% sequences are of unknown function. The library could be extensively used in developing DNA markers, sequencing ESTs, mining new genes, identifying positional cloning and candidate genes, and developing microarrays in maize genomics research.__________From Molekulyarnaya Biologiya, Vol. 39, No. 2, 2005, pp. 198–206.Original English Text Copyright © 2005 by Z. Zhang, F. Zhang, Tang, Pi, Zheng.This article was submitted by the authors in English.     

Partial sequence analysis of randomly selected watermelon [Citrullus lanantus (Thunb.) Mansf.] cDNA clones

An expressed sequence tag (EST) is simply a segment of a sequence over 150 bp from a randomly selected cDNA. EST helps to quickly identify functions of expressed genes and to understand the complexity of gene expression with database comparison. Sequencing of random cDNA clones can be applicable to discovery of new genes, mapping of the genome, identification of coding regions in genomic sequences, and antisense method. To accomplish these goals, in this research, randomly selected cDNA sequencing was performed with watermelon plant. Among 30 clones picked up and analyzed, all clones had an insert length over 0.5 kb. The average size of insert was about 1.3 kb. The size range of most cDNA insert was 1.0–2.0 kb. For sequence comparison, data from the coding region at 5′ end of selected cDNA should be much more informative than those from the untranslated 3′ tail. Thirty clones were sequenced from one end (5′ end). Of these, 29 had no poly (A) tail in this direction, while only one was inverted. Thus, this library is over 96% unidirectional. Two clones had homologies to ribulose bisphosphate carboxylase/oxigenase (Rubisco) small subunit precursor gene. Thirteen cDNAs had high degree of sequence similarity to genes from other organisms. The remaining cDNA clones seem to be new genes not only in watermelon but also in all organisms.