铜绿假单胞菌噬菌体PaP4的分离与鉴定

[目的]鉴定一株新分离的铜绿假单胞菌噬菌体PaP4的生物学特性.[方法]双层琼脂培养法制备PaP4的单个噬斑,观察噬斑特点;用聚乙二醇8000浓缩PaP4颗粒后,再用氯化铯密度梯度离心纯化;用透射电子显微镜观察磷钨酸负染色的PaP4颗粒;提取PaP4基因组核酸,通过限制性内切酶图谱分析其核酸类型;按照感染复数(MOI)分别为0.000 1、0.001、0.01、0.1、1和10加入噬菌体纯培养液和宿主菌,充分裂解细菌后,测定噬菌体滴度;以MOI=10的比例加入噬菌体及宿主菌,进行一步生长实验,绘制一步生长曲线.[结果]PaP4的噬斑直径约3 mm-5 mm,圆形透明边缘清晰;PaP4噬菌体呈多面体立体对称的头部,直径约50 nm,有一个约30 nm的短尾;限制性酶切实验表明PaP4基因组为双链DNA;当MOI为0.001时PaP4感染其宿主菌产生的子代噬菌体滴度最高;用一步生长曲线描绘了其生长特性.[结论]PaP4属dsDNA短尾科裂解性噬菌体;最佳感染复数是0.001;由一步生长曲线得出感染宿主菌的潜伏期是25 min,裂解期是20 min,平均裂解量是150.     

一株感染铜绿假单胞菌的双链RNA噬菌体PaP6的分离和鉴定

【目的】鉴定一株新分离的铜绿假单胞菌噬菌体PaP6的生物学特性。【方法】利用铜绿假单胞菌临床分离株PA038为宿主,从西南医院污水中分离得到一株裂解性噬菌体PaP6,观察其噬斑特点;氯化铯密度梯度离心纯化噬菌体颗粒后,用透射电子显微镜观察噬菌体形态;提取PaP6基因组,通过DNA酶和RNA酶酶切,做基因组酶切图谱分析;按照感染复数(MOI)分别为10、1、0.1、0.01、0.001和0.000 1加入噬菌体和宿主菌,裂解细菌后,测定噬菌体滴度;以MOI=10的比例加入噬菌体和宿主菌,绘制一步生长曲线;用112株铜绿假单胞菌临床分离株检测PaP6宿主谱。【结果】PaP6的噬斑直径约2 mm-4 mm,圆形透明,边缘清晰;PaP6噬菌体呈多面体立体对称的头部,直径约45 nm;酶切图谱表明PaP6基因组对DNase不敏感,对RNase敏感,未酶切基因组具有3节段双链RNA(dsRNA),长度分别约为9.0、4.5、3.5 kb,共约17 kb;当MOI为0.1时PaP6感染其宿主菌产生的子代噬菌体滴度最高,达到3.4×109 PFU/m L;用一步生长曲线描绘了其生长特性;PaP6可以感染40.1%的临床分离株,是一株比较广谱的噬菌体。【结论】首次报道了一株铜绿假单胞菌的ds RNA分节段噬菌体,分类学上属于囊病毒科,该噬菌体具有较广的宿主谱,在噬菌体治疗领域具有应用前景。     

8株动物源编码Stx2短尾噬菌体的生物学特性

[目的]对8株源自大肠杆菌O157编码Stx2毒素的噬菌体生物学特性进行研究.[方法]丝裂霉素C诱导8株大肠杆菌O157菌株释放噬菌体,采用PCR作初步鉴定,分离、纯化噬菌体基因组,随机引物法地高辛(DIG)标记stx2基因片段作为探针,对纯化的噬菌体采用Southernblot进行Stx2噬菌体再次鉴定,透射电子显微镜观察纯化的8株Stx2噬菌体的形态特征,通过限制性内切酶图谱分析,确定噬菌体的核酸类型和基因组大小、以及限制性内切酶酶切片段多态性,并分析噬菌体的蛋白质组成特征.[结果]Southern blot证实分离的8株噬菌体为Stx2噬菌体,电镜下观察的各株Stx2噬菌体形态一致,头部均为正六边形,尾部很短,属于短尾噬菌体科,各株噬菌体之间存在相同的蛋白结构模式,基因组为双链DNA,限制性内切酶片段长度表现出一定的多态性,噬菌体的基因组大小从48.0-65.3 kb不等.[结论]来源不同菌株的8株编码Stx2噬菌体均为短尾噬菌体,其蛋白结构模式一致,但基因组具有不同组成.     

MAPPING重组噬菌体中插入片段的“分/合”策略

随着胚胎干细胞基因打靶技术不断推广应用,如何有效地从小鼠基因组DNA文库中筛选得到基因组DNA并进行结构分析(如限制性内切酶酶切图谱分析,即mapping等)已成为一个被普遍关心的问题.设计应用了“分/合”的策略,即先对重组噬菌体插入片段制备一套亚克隆,在对亚克隆进行详细的mapping的基础上,再对完整的大分子噬菌体DNA进行酶切分析,将两者相结合,可以分析得到完整的酶切图谱.应用此策略,简便准确地对所克隆的含有小鼠凝血因子IX基因组DNA的大分子插入片段进行了限制性内切酶酶切图谱分析,结果得到了DNA印迹等的验证.     

人乙型肝炎病毒(HBV)adr亚型基因组的多态性

由乙型肝炎adr亚型病毒(HBVadr)携带者26人的混合血清,得到了HBVadr基因组克隆株(PADR)158株,对这些克隆株进行四种限制性内切酶(BglⅡ,HindⅢ,PstⅠ,XhoⅠ)切点测定,并对其中S株的13种限制性内切酶图谱进行比较研究,发现同为adr亚型病毒,其基因组的限制性酶切图谱存在差异。另外,通过HindⅢ)切点得到的12个克隆株(PADR-H),也进行了酶切图谱分析。在这170个克隆株中,已经发现了5种类型的HBVadr基因组限制性酶切图谱,其中有6种酶(AvaⅠ,EglⅠ,BglⅡ,HincⅡ,HindⅢ,HpaⅠ)的7个变异点。本文报道了HBVadr基因组的多态性现象。     

噬菌体PaP2推定基因功能的研究

一个生物体基因组测序工作的完成 ,是进行基因组学和功能基因组学研究的基础 ,只是巨量工作的开始。本文通过运用GeneMark以及softberryfgenesV等软件在铜绿假单胞菌噬菌体PaP2基因组上共发现了 5 8个推定基因的编码区 ,为了解这些基因的功能 ,进行了两个方面的研究。一方面是将纯化噬菌体颗粒进行SDS PAGE分析 ,发现噬菌体PaP2至少含有 10个衣壳蛋白质 ,再转印到PVDF膜上 ,分别剪下各条带进行蛋白质N 末端氨基酸测序。根据蛋白质实测分子量 ,从 5 8个ORFs中找出编码相近分子量产物的ORFs ,再根据N 端氨基酸序列确定衣壳蛋白质的…     

DNA序列中限制酶切割位点的分布

本文以人类、小鼠、大鼠和病毒基因组中的DNA序列为材料,分析了其中40种II型限制性核酸内切酶识认位点的数量和分布情况。发现人鼠序列中绝大多数酶的切点数量可以通过序列中单核苷酸或双核苷酸的频率来预测,而切点在序列上的分布也是随机的。例外的情况是人鼠序列中酶EcoRII(识认CCWGG)和MnlI(CCTC)的切点显著偏多,而DpnI*(GATC)的切点显著偏少;MnlI的切点倾向于聚集一处。病毒基因组中酶切位点也基本上是随机分布,但基因组间差异很大,跟人鼠序列差别也大,特别是噬菌体T7中有多达17种酶的切点显著偏少。文中讨论了所得结果对构建限制酶切图谱的理论计算以及对限制酶显带机理的意义,特别指出显带过程在酶的切点达到所要求的浓度时,跟酶的识认片段的专一性、酶切位点的数量都没有关系,而取决于染色体不同区段抵抗酶切破坏的能力。     

鳞翅目基因组IIB型内切酶位点的统计分析

IIB型限制内切酶能够识别并切割特异酶切位点两端特定距离的DNA,形成粘性末端的30 bp左右的等长DNA片段。利用其特性与限制性酶切位点关联测序技术(RAD)相结合发展出2b-RAD简化基因组测序技术,应用于遗传图谱构建、种群遗传结构分析、性状定位以及细菌分型等多种研究领域。构建2b-RAD测序文库之前,需要对基因组中的IIB型限制内切酶位点进行预测与统计分析,制定有效的测序文库构建方案。本文利用Python语言构建分析基因组中IIB型限制内切酶位点的流程,预测并统计6个鳞翅目代表物种基因组含有的8个商业化IIB型限制内切酶的酶切位点,比较了各个基因组与IIB型限制内切酶之间含有的酶切位点总量、重复序列数量以及酶切间隔长度的关系,为在昆虫基因组中进一步试行2b-RAD研究提供了参考。     

噬菌体PaP3末端酶大亚单位的克隆表达

末端酶 (terminase)是双链DNA病毒包装过程中 ,将病毒基因组多串联体 (concatemer)与病毒前衣壳连接 ,切割并转移单拷贝基因组进行前衣壳 (procapsid)的异源寡聚体 ,由一个大亚单位及 1～ 7个小亚单位组成。大亚单位具有ATP酶和核酸酶活性 ,在全酶活性中起到重要的作用。由我室分离并完成测序的绿脓杆菌噬菌体PaP3(GeneBank序列号 :AY0 78382 )为双链DNA病毒 ,其中4 0 6 93 4 2 14 1基因编码末端酶大亚单位。本研究采用PCR技术从噬菌体PaP3基因组中扩增出编码噬菌体PaP3末端酶大亚单位的目标片段 ,将目标片段插入原核表达载体 pQE…     

介绍几种DNA的限制性内切酶图谱分析方法

限制性内切酶图谱(restriction map),又称物理图谱(physical map),是将各种限制性内切酶的切点在DNA上定位,绘制成的图谱(以下简称酶谱)。1968年Meselsen等人首先发现了限制性内切酶,至今已从四百多种菌株中分离了限制酶。1973年,Danna等绘制了SV40的简单图谱。此后各种DNA的酶谱不     

一株新分离的肠杆菌噬菌体的快速遗传鉴定及其宿主识别基因的快速克隆

以大肠杆菌8099为宿主自医院污水中分离出一株肠杆菌噬菌体IME08,其遗传物质经RNA酶、DNA酶处理证实其为DNA,用限制性内切酶处理该DNA证实其为双链DNA。利用随机引物PCR技术扩增并克隆该噬菌体基因组的随机片段,经测序后同源比对,判断该噬菌体是一株新的T4-like噬菌体。根据4株T4-like噬菌体 (T4,JS98,T2及K3) 宿主识别基因 (g37) 5'端的高度保守序列,采用随机PCR与巢式PCR结合的“基因组跳跃”策略快速克隆出了该噬菌体的宿主识别基因g37和g38。     

人类基因组辞汇

人类基因组辞汇柴建华Ｐｈａｇｅ噬菌体。没有细胞结构的最简单的生命,是一种寄生在细菌细胞内的病毒。见ｖｉｒｕｓ。ＰｈｙｓｉｃａｌＭａｐ物理图谱。标示可识别的ＤＮＡ位标在ＤＮＡ分子上位置的图（如限制性酶切点,基因等）。距离以ｂｐ表示。对于人类基因组,最低分辨率的物理图谱是２４个不同染色体的分带图,最高分辨率的物理图谱是染色体的全部核苷酸顺序。     

裂解型布鲁氏菌噬菌体的分子特征研究

目的:研究布鲁氏茵噬茵体Tb(Tbilisi)的形态学和分子生物学特征.方法:采用透射电镜观察噬茵体颗粒形态,双层琼脂法观察噬斑形态,梯度密度离心纯化噬茵体颗粒,提取噬茵体基因组,采用多种限制性内切酶(S1,DNase I,RNase A,BamHI)对基因组进行酶切琼脂糖凝胶电泳,SDS-PAGE观察噬茵体颗粒全蛋白片段.结果:Tb噬茵体电镜下显示头部直径为57±2nm,短尾(32±3mm长),分类学属于短尾噬茵体科.培养48小时后显示清晰噬斑,大小为2～3mm.核酸结构分析均表明Tb噬菌体基因组为线性dsDNA分子.基因组DNA经限制性内切酶BamHI酶切产生2条清晰条带,分子量在34.5kb左右.SDS-PAGE全蛋白电泳显示Tb噬菌体含有9条主要结构蛋白.结论:该研究证实了Tb噬菌体属于短尾病毒科噬菌体,对宿主菌存在裂解效应并产生2～3mm清晰透亮形态的噬斑,基因组为dsDNA分子,全蛋白包含9条主要的结构蛋白.该研究结果为布鲁氏菌噬菌体的分子水平的研究提供了新的研究基础.     

放线菌噬菌体φHAU_3中噬菌斑形成必需功能区的克隆和定位

放线菌噬菌体φHAU3是以吸水链霉菌应城变种10-22为指示菌,筛选获得的一个广谱性噬菌体,其基因组大小约为53kb,具有粘性末端。已成功地将44.7kb的φHAU3 DNA克隆到pIJ255上,构建成噬粒(Phasmid)pIJ8300;46.8kb的φHAU3 DNA克隆到pIJ285上,构建成pIJ8301。采用部分酶解和Southern杂交的方法,制作了pIJ8300和pIJ8301被Asp718和Bgl Ⅱ酶切的限制酶图谱,又综合单,双和多酶切分析的结果,定位了单一的Pvu Ⅱ和NcoI切点。综合噬粒pIJ8300和pIJ8301的特性,已将φHAU3中噬菌体功能的必需区定位在41kb的范围内。这些结果为以φHAU3为母体发展新的放线菌噬菌体奠定了良好的基础。     

末端终止法测定非特异性降解的DNA片段的顺序

用末端终止法测定DNA顺序的方法之一是用限制性内切酶将被测DNA降解,再与噬菌体M_(13)DNA重组、克隆。提取单链DNA做为模板,进行顺序测定。寻找一些非特异性的降解工具取代内切酶,有一定的经济价值,而且还可以扩大方法的应用范围。尤其在多酶切点的载体M_(13)mp系列出现后,更为DNA重组提供了方便。本文用酶法及超声波法切剪,得到了适合在M_(13)mp_8载体中以平齐末端重组的片段。一、材料与方法 1.材料小牛胸腺DNA及质粒PJDB     

铜绿假单胞菌噬菌体的分离鉴定及耐噬菌体突变频率测定*

用铜绿假单胞菌为宿主菌自污水中分离到3株不同的铜绿假单胞菌噬菌体,命名为PaP1、PaP2及PaP3者均为DNA双链噬菌体,基因组大小分别约为47kb、34kb及24kb。3株噬菌体原液滴度（pfu）分别为10⁹/mL、10¹¹/mL和10¹¹/mL。PaP1为裂菌性噬菌体,PaP2及PaP3为溶原性噬菌体。电镜观察,3株噬菌体头部均为多面体立体对称颗粒,直径分别约为70nm、55nm和65nm。PaP1属肌尾噬菌体科,PaP2和PaP3属     

热带假丝酵母79线粒体DNA的研究

本文报道了热带假丝酵母线粒体DNA的分离纯化、性质和酶切图。此线粒体DNA用电镜观察有线状、开环状和闭环状三种形状;在氯化铯中浮力密度为1.691g/cm~3;解链温度为80.0℃。限制性内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ和PstⅠ在此线粒体DNA上分别有6、5和3个切点。根据酶切片段计算分子量为22.97×10~6道尔顿。同时,用双酶切方法得到此线粒体DNA的内切酶图谱。     

蓖麻蚕基因组中5S DNA的组织

用Southern方法研究了蓖麻蚕(Attacus ricini)5S核糖体RNA (5S rRNA)的基因在基因组中的组织情况。5S rRNA基因以顺向串联的多拷贝形式组成了5S DNA家族。家族的每个成员(5S DNA的重复单位)的大小为260bp(碱基对),即由120bp的基因区和140bp的空间区顺序所组成。在5S DNA的家族中没有限制性内切酶EcoRI、BamHI、PstI和BglⅡ的切点。限制性内切酶MboI、Hhal在每个重复单位中有一个切点,都是位于基因的顺序中。5S DNA重复单位的空间区顺序是不均一的,这一点可由限制性内切酶Hae Ⅲ和Alu Ⅰ切点的不规则分布而得以揭示。     

RAD-seq技术及其在昆虫学研究中的应用

限制性酶切位点关联DNA测序技术(restriction-site-associated DNA sequencing,RAD-seq)是在二代测序技术基础上发展起来的一种简化基因组技术(reduced-representation genome sequencing,RRGS)。RAD-seq利用限性核酸内切酶使基因组片段化,经过修饰后连接含标记的接头构建文库并进行测序。因其具有操作简单、实验成本低、通量高等优点,在分子生态学、进化基因组学、保护遗传学等领域得到应用。目前发展起来的RAD-seq技术主要包括利用稀有酶和物理打断方式进行基因组片段化的mbRAD、利用稀有酶和常见酶组合酶切的方式进行基因组片段化的ddRAD、利用IIB型限制性内切酶得到短片段文库的2bRAD、利用同裂酶和Illumina试剂盒建库的ezRAD和完全利用Nextera试剂盒建库的nextRAD。本文对每种RAD-seq技术的特点及其在昆虫种群遗传学、群落生态学、物种界定、系统发育和遗传连锁图谱构建等研究领域的应用进行了综述。     

单纯疱疹病毒2型特异性DNA片段的克隆和鉴定

用核酸限制性内切酶BamHI对单纯疱疹病毒2型(HSV—2)的DNA进行酶解,回收位于基因组中的反向重复序列区的Bam HIG片段,然后将其克隆在载体质粒PUC 8的Bam HI切点上,进一步用核酸限制性内切酶Eco RI和KPNI对这一重组质粒联合酶解,移去EcoRI—KPNI小片段,经末端修饰后,将其连接得到新的重组质粒pRC102,它含有一小段HSV—2的DNA序列。以此质粒为探针,分别与HSV—1、HSV—2及细胞DNA进行斑点杂交;与HSV—1和HSV—2酶解后的DNA片段进行Southern转印系交。两组实验结果显示,pRC102质粒DNA只与HSV—2 DNA特异性杂交,其HSV—2的型特异性良好。