ε-聚赖氨酸生物制造及其在食品防腐领域的应用

ε-聚赖氨酸是由L-赖氨酸α-COOH和ε-NH2 缩合而成,由微生物合成的一种同型氨基酸聚合物.ε-聚赖氨酸是一种优良的生物防腐剂,对G+、G-、酵母菌和霉菌都有较好的抑菌效果.本文综述了ε-聚赖氨酸的来源与性质、产生菌的筛选与改造、发酵过程优化与调控、ε-聚赖氨酸分解酶、ε-聚赖氨酸合成机理和ε-聚赖氨酸酯化结构与...     

ε-聚赖氨酸产生菌TUST-2的分离鉴定

【目的】ε-聚赖氨酸是一种天然氨基酸同聚物,本研究目的为分离筛选新的ε-聚赖氨酸产生菌。【方法】采用一种新的分离方法从土壤中分离ε-PL产生菌。分离方法含3步:(1)富集培养ε-PL耐受菌;(2)通过改进的Nishikawa方法筛选;(3)挑选高浓度ε-PL耐受菌株。【结果】从海南省土样中分离获得ε-聚赖氨酸产生菌TUST-2。分类和形态特征属链霉菌属。16S rDNA序列分析比对结果表明TUST-2属淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)。经特征反应分析、水解物分析、红外光谱、1H NMR、13C NMR和MALDI-TOF-MS分析表明TUST-2发酵产物为ε-聚赖氨酸。【结论】根据16S rRNA基因序列比对和形态及生理生化特征表明ε-聚赖氨酸产生菌TUST-2属于淀粉酶产色链霉菌,命名为淀粉酶产色链霉菌TUST-2。     

小白链霉菌ε-聚赖氨酸降解酶生理功能分析

[目的] 研究小白链霉菌（Streptomyces albulus）中ε-聚赖氨酸降解酶（Pld）的分布特征和生理功能。[方法] 利用生物信息学手段对已报道的ε-聚赖氨酸（ε-PL）产生菌的Pld进行挖掘和分析,再通过遗传学方法对小白链霉菌M-Z18基因组中存在的两种pld进行敲除、回补和过表达,最后研究重组菌降解ε-PL能力、最小ε-PL抑制浓度（MIC）及其合成ε-PL情况。[结果] PldⅠ和PldⅡ广泛且同时分布于小白链霉菌中,蛋白序列高度保守;PldⅠ、PldⅡ在小白链霉菌M-Z18中均能行使降解ε-PL的功能,但PldⅡ降解活性占主导地位且PldⅠ和PldⅡ对降解ε-PL具有协同作用;pldⅠ、pldⅡ过表达重组菌对ε-PL的MIC值显著提高,其中双过表达pldⅠ和pldⅡ菌株对ε-PL的MIC值是出发菌株的2.19倍。构建的pld重组菌与出发菌株相比,在考察pH值范围内（pH 3.0-5.5）的ε-PL产量未表现出显著差异。[结论] 小白链霉菌中广泛分布PldⅠ和PldⅡ且序列高度保守,主要生理功能是保护小白链霉菌在中性环境中免受自身产物ε-PL的抑制。     

ε-聚赖氨酸生物合成研究进展

ε-聚赖氨酸(ε-PL)是一种可食用对人和环境无毒害可生物降解的天然生物材料。本文以聚赖氨酸的研究历史为主线,对ε-PL的合成与降解进行了综述并预测了ε-PL可能的代谢途径,最后展望了我国聚赖氨酸研究的发展前景。     

Genome shuffling筛选ε-聚赖氨酸高产菌及其对代谢流量分配的影响

【目的】从代谢流量分配的角度,探讨Genome shuffling导致链霉菌ε-聚赖氨酸合成量提升的原因。【方法】从葡萄糖耐受型的亲本菌株Streptomyces sp.AS32和ε-聚赖氨酸耐受型的亲本菌株Streptomyces albulus F15出发,进行三轮Genome shuffling,筛选得到ε-聚赖氨酸产量提高的链霉菌株Streptomyces sp.AF3-44,采用通量分析方法构建链霉菌ε-聚赖氨酸合成代谢网络,并对上述3株菌的代谢通量进行比较。【结果】AF3-44的ε-聚赖氨酸摇瓶产量为3.1 g/L,较AS32和F15分别提高了34%和29%。3株菌株中AS32三羧酸循环(TCA)的代谢通量最高;F15磷酸戊糖途径(PPP)代谢通量最高;AF3-44流向赖氨酸合成前体天冬氨酸以及ε-聚赖氨酸的通量最高,TCA和PPP通量位于两亲本菌株的中间水平,其中TCA中流向异柠檬酸的通量分别为AS32和F15的77%和116%,PPP中流向5-磷酸核酮糖的通量分别为AS32和F15的149%和92%。【结论】Genome shuffling导致了代谢流的重新分布,流向前体赖氨酸和ε-聚赖氨酸通量的增加,以及PPP和TCA通量配比的改变是链霉菌ε-聚赖氨酸合成量增加的重要因素。     

核糖体工程技术选育ε-聚赖氨酸高产菌株

【目的】利用核糖体工程技术选育Streptomyces albulus AS3-14的链霉素和利福平双重抗性突变株,以提高其ε-聚赖氨酸合成能力。【方法】通过链霉素抗性筛选,获得链霉素抗性的ε-聚赖氨酸产量提高突变株;在此基础上,继续筛选其利福平抗性突变株,实现链霉素和利福平双重抗性ε-聚赖氨酸高产菌选育。【结果】获得的双重抗性高产突变株Streptomyces albulus WG-608的ε-聚赖氨酸摇瓶产量达到3.7 g/L,5 L发酵罐补料分批发酵ε-聚赖氨酸产量达到53.0 g/L,较出发菌株分别提高了42.3%和32.5%。【结论】链霉素和利福平双重抗性选育能够显著提高ε-聚赖氨酸产生菌Streptomyces albulus的产物合成能力。     

ε-聚赖氨酸高产菌选育与发酵性能评价

【目的】选育ε-聚赖氨酸(ε-PL)高产菌,并探究不同碳源对其发酵性能的影响。【方法】借助基因组重排和核糖体工程两种育种手段强化ε-PL产生菌的合成能力,并利用p H冲击工艺评价不同碳源对ε-PL发酵的影响。【结果】经过4轮基因组重排和4轮核糖体工程连续选育,获得1株高产突变株Streptomyces albulus GS114,其摇瓶ε-PL产量达到3.0 g/L,较出发菌提高了1.7倍。该改造菌株在5 L发酵罐中分别以葡萄糖和甘油为碳源进行192 h的补料-分批发酵时,ε-PL发酵产量分别达到了43.4 g/L和45.7 g/L,较出发菌提高了11.0%和14.9%,而菌体量分别减少了24.0%和33.2%,ε-PL得率提高了34.2%和30.7%。【结论】基因组重排结合核糖体工程育种是一种有效的ε-PL高产菌选育手段,研究结果将为ε-PL高产菌改造和工业生产碳源选择提供直接指导。     

一株ε-多聚赖氨酸产生菌的筛选与鉴定

【目的】筛选和鉴定产ε-多聚赖氨酸(ε-polylysine,ε-PL)的放线菌菌株,测定所产ε-PL的结构和聚合度,研究其抑制微生物生长的效果。【方法】利用亚甲基蓝和ε-PL因静电排斥而形成透明圈原理筛选ε-PL产生菌,采用Itzhaki方法复筛。考察分离菌株的形态、生理生化特征和16SrRNA基因、gyrB基因序列的同源性鉴定菌种。结合其波谱特征对其所产ε-PL进行结构和聚合度鉴定。采用抑菌圈法考察所产ε-PL对7株指示菌的抑菌活性。【结果】获得3株能够产生ε-PL的放线菌,其中X-18的ε-PL产量最高,达到0.8g/L,综合形态、生理和分子生物学分析结果,鉴定为白色链霉菌(Streptomyces albulus)。根据波谱学特征,并与标准品比对,证实该ε-PL分子聚合度为25–30,抑菌实验结果显示,它对细菌的抑菌效果明显好于真菌。【结论】从土壤中分离到1株抑菌效果较好的ε-PL产生菌S. albulus X-18,丰富了ε-PL产生菌资源。     

ε-聚赖氨酸生物合成及其产生菌遗传转化研究进展

ε-聚赖氨酸(ε-poly-L-lysine,ε-PL)是由25-35个L-赖氨酸(L-lysine)通过α-ε酰胺键连接的具有很强抗菌活性的聚合物,是自然界中迄今为止仅发现的2种均聚氨基酸(ε-聚赖氨酸和γ-聚谷氨酸)之一。目前,研究发现ε-聚赖氨酸的合成酶是一种非核糖体肽合成酶,它催化前体物质L-lysine经多轮缩合反应合成链长不均一的ε-聚赖氨酸,与I型聚酮合成酶的合成过程相似。ε-聚赖氨酸的合成不受降解酶控制。同时,针对产生菌遗传转化的穿梭质粒载体pLAE001和pLAE003已构建成功,为进一步探索ε-聚赖氨酸生物合成提供了条件。本文主要就ε-聚赖氨酸生物合成及产生菌遗传转化体系进行综述。另外,扼要介绍了作者所在课题组的相关研究工作、取得的进展并提出了相应的见解,论文最后部分对组合生物合成在ε-PL产生菌菌种改造中的应用前景进行了探讨。     

ε-聚赖氨酸发酵过程的活性变化及发酵调控

摘要:【目的】作为一种次级代谢产物,ε-聚赖氨酸生物合成受不同因素制约,为评价细胞活性对ε-聚赖氨酸生物合成的影响,研究发酵过程细胞活性、ε-聚赖氨酸合成及其它发酵参数变化,基于此改进发酵工艺。【方法】以BacLight Live/Dead和5-氰基-2,3-二甲苯基氯化四唑(5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chloride,CTC) 为荧光探针,激光扫描共聚焦显微镜监测不同发酵时期细胞活性,并分析pH、细胞生长、ε-聚赖氨酸生物合成以及葡萄糖利用;通过向ε-聚赖氨酸合成期细胞添加酵母粉调控细胞活性改进发酵工艺。【结果】BacLight Live/Dead为探针的共聚焦显示ε-聚赖氨酸发酵过程生长期(0－16 h)的细胞大都具有活性;CTC作为探针的分析显示生长期及ε-聚赖氨酸合成期前期(16－30 h)细胞活性高,ε-聚赖氨酸合成终止时细胞仅显示微弱活性;调控ε-聚赖氨酸合成期细胞活性的发酵工艺ε-聚赖氨酸终浓度达2.24 g/L(对照1.04 g/L)。【结论】调控ε-聚赖氨酸合成期细胞活性的发酵工艺可有效促进ε-聚赖氨酸生物合成。     

链霉菌M-Z18膜蛋白ε-聚赖氨酸降解酶的分离纯化、酶学性质及应用

【目的】研究链霉菌Streptomyces sp.M-Z18ε-聚赖氨酸降解酶(Pld)的分离纯化及其生理生化特性,并利用该酶制备低聚合度ε-聚赖氨酸(ε-PL)。【方法】菌体细胞经超声破碎、NaSCN溶解和HiTrapTMButyl HP疏水层析制备到Pld,随后研究了其酶学性质、动力学和降解ε-PL过程,最后利用常量稀释法比较了不同聚合度范围ε-PL的最小抑菌浓度。【结果】从Streptomyces sp.M-Z18细胞膜上分离纯化到Pld,纯化倍数为80.4倍,回收率达到59.3%。以L-赖氨酰对硝基苯胺为底物,酶促反应的最适温度为37℃,最适pH为7.0,动力学常数Km为0.621 mmol/L,Vmax为701.16 nmol/min·mg;酶活在pH 7.0-10.0和50℃以下稳定。降解ε-PL实验发现,纯化到的Pld以内切方式降解ε-PL。抑菌实验表明,高聚合度ε-PL(30-35)对细菌的抑制效果较好,而低聚合度ε-PL(8-20)更有利于抑制酵母菌的生长,各种聚合度ε-PL对霉菌的生长抑制均较差。【结论】从ε-PL产生菌中分离纯化到内切型ε-PL降解酶,发现不同聚合度范围ε-PL对微生物的抑制能力存在显著差异。     

链霉菌ε-聚赖氨酸发酵过程中的氧化胁迫效应

【目的】探究ε-聚赖氨酸(ε-PL)产生菌对p H和ε-PL的耐受性、氧化胁迫与ε-PL合成之间的关系。【方法】选取3株ε-PL产生菌Streptomyces sp.AF3-44、Streptomyces sp.AS32和Streptomyces albulus F15,比较其在发酵性能、p H和ε-PL耐受性以及抗氧化胁迫能力上的差异,并对菌株发酵过程的活性氧成因进行分析。【结果】在3株菌中AF3-44具有最强的p H和ε-PL耐受性及抗氧化胁迫能力,因而在发酵后期能够保持良好的细胞活性和最高的ε-PL浓度;ε-PL引起的氧化胁迫主要发生在发酵前期,而发酵中后期氧化胁迫的产生主要由酸性p H导致。【结论】提高链霉菌ε-PL发酵过程中的抗氧化胁迫能力,可提升菌体活力和发酵水平。     

大剂量紫外诱变选育ε-聚赖氨酸高产菌

以白色链霉菌Z-18为出发菌株,经大剂量紫外诱变处理,用S-2-氨基乙基-L-半胱氨酸（AEC）氨基酸结构类似物平板定向育种方法,获得1株ε-聚赖氨酸高产菌C-18,其发酵液中ε-聚赖氨酸产量较出发菌株提高42．9％。在含有50g／L葡萄糖的培养基中,ε-聚赖氨酸积累可达1．23g／L。     

噬菌体裂解酶Lysin1902原核表达及其与ε-聚赖氨酸联用效果评价北大核心

【目的】研究裂解酶Lysin1902与ε-聚赖氨酸(ε-PL)对大肠杆菌O157:H7的协同抗菌作用。【方法】通过Mega构建进化树、使用在线工具等分析大肠杆菌噬菌体裂解酶Lysin1902氨基酸序列组成和结构等;原核表达并纯化Lysin1902;通过平板裂解实验检测Lysin1902对大肠杆菌O157:H7灭活菌株的裂解活性;用96孔板法检测Lysin1902或ε-PL的活菌裂解能力;棋盘法验证Lysin1902和ε-PL联用效果。【结果】体外成功表达并纯化了Lysin1902。Lysin1902对大肠杆菌O157:H7灭活菌株具有裂解活性,但不能有效裂解活的大肠杆菌。噬菌体裂解酶与ε-PL联用结果表明,加入Lysin1902后,ε-PL能够完全控制大肠杆菌O157:H7增殖的使用浓度由0.7mg/mL降低到0.1 mg/mL。【结论】体外原核表达并纯化Lysin1902,其单独使用对活的大肠杆菌O157:H7无裂解活性,但与ε-PL联用可显著提高ε-PL对大肠杆菌O157:H7的裂解能力。     

ε-聚赖氨酸的微生物合成与降解

ε-聚赖氨酸为一种均聚氨基酸,由单个赖氨酸分子在α-羟基和-ε氨基形成酰胺键而连接成的多聚体,目前主要通过白色链霉菌(Streptomyces albulus)的微生物合成进行生产,具有抑菌谱广、热稳定性好、在酸碱条件下稳定等特点,作者综述了ε-聚赖氨酸微生物合成的方法、可能的生物合成和降解机制等,并简要介绍ε-聚赖氨酸作为食品保鲜剂在食品和生物高分子材料在基因治疗、药物载体、基因芯片、高吸水性材料等方面的应用前景。     

ε-聚赖氨酸高产菌株的选育

正ε-聚赖氨酸(PL)由链霉菌合成、分泌[1],对细菌、霉菌、酵母菌等有强烈的生长抑制作用,是一种被广泛应用的生物食品防腐剂。但野生型产生菌的ε-PL合成能力都比较低,利用物理和化学诱变,选育S-2-氨基乙基-L-半胱氨酸和甘氨酸抗性突变株,已见报道的最高摇瓶产量为2.11 g/L[2];应用等离子诱变技术和基因组重排技术,可将ε-PL最高摇瓶产量提高到3.11 g/L[3]。但传统的选育手段耗时、耗     

非核糖体肽合成酶缩合结构域基因片段克隆

从大连渤海海域筛选出1株放线菌L1,结合形态观察、生理生化实验和16S rDNA分子鉴定,确定L1属于链霉菌属球孢链霉菌(Streptomyces globisporus)。根据GenBank发布的非核糖体肽合成酶(NRPS)序列设计引物,从放线菌L1的基因组DNA中扩增获得NRPS基因片段。测序结果及比对分析表明该片段属于NRPS缩合结构域部分序列。三维建模显示其结构呈V型,包含缩合结构域核心序列,与数据库已知结构相一致,可以推断该克隆片段为NRPS缩合结构域基因片段,为后续深入研究缩合结构域特异性与相关NRPS功能提供基础。     

搅拌转速和pH对ε-聚赖氨酸发酵的影响

采用5L自控式发酵罐研究了ε-聚赖氨酸分批发酵过程中搅拌转速和pH对发酵指标以及菌体细胞形态的影响。提高搅拌速率对菌生长和ε-赖氨酸的合成有显著的促进作用;但当搅拌转速达到400r／min以上时,由于剪切力过大导致细胞死亡,ε-聚赖氨酸产量下降。当pU维持5以上,有利于菌体生长;pH4．0左右可促进￡一聚赖氨酸的合成。搅拌转速350r／min和控制pH4．0时可获得最大的￡一聚赖氨酸产量2．95g/L,菌体量9．33g／L;此时产物E．聚赖氨酸对葡萄糖的得率和对细胞干重的比生成速率分别为0．062g／g和0．006g／g．h。通过对比不同发酵条件下ε丝体的形态变化,发现当菌丝球比较均匀、形态无较大差别、具有致密程度相当的核心时,有利于￡一聚赖氨酸形成。     

具有双重抗生素抗性的ε-聚赖氨酸高产菌株选育及生理特性

以ε-聚赖氨酸产量为1.60g/L的Streptomyces albulus M-Z18为出发菌株,利用核糖体工程技术选育具有双重抗生素抗性的ε-聚赖氨酸高产菌株,并对高产菌株和出发菌株的生理生化性能进行比较。通过链霉素诱变成功选育出了1株遗传稳定的ε-聚赖氨酸产生菌S.albulus S-7,ε-聚赖氨酸产量为2.03g/L;对S.albulus S-7叠加巴龙霉素,获得1株遗传稳定的具有双重抗性的ε-聚赖氨酸产生菌S.albulus SP-14,ε-聚赖氨酸产量为2.37g/L,比出发菌株S.albulus M-Z18的ε-聚赖氨酸产量增加了48.10%。使用链霉素和巴龙霉素选育具有双重抗生素抗性的ε-聚赖氨酸高产菌株是一种有效的手段。     

产ε-聚赖氨酸菌株生物合成条件研究

对一株产ε-聚赖氨酸Kitasatospora sp.PL6-3菌株进行生理生化特性研究。并通过5L发酵罐中ε-PL的合成条件的考察,发现在搅拌转速为350r／min,pH4.0,初糖浓度为3％并补糖的操作条件下ε-PL的质量浓度可高达6.65g/L,产率提高近10倍。