链霉菌ε-聚赖氨酸发酵过程中的氧化胁迫效应

【目的】探究ε-聚赖氨酸(ε-PL)产生菌对p H和ε-PL的耐受性、氧化胁迫与ε-PL合成之间的关系。【方法】选取3株ε-PL产生菌Streptomyces sp.AF3-44、Streptomyces sp.AS32和Streptomyces albulus F15,比较其在发酵性能、p H和ε-PL耐受性以及抗氧化胁迫能力上的差异,并对菌株发酵过程的活性氧成因进行分析。【结果】在3株菌中AF3-44具有最强的p H和ε-PL耐受性及抗氧化胁迫能力,因而在发酵后期能够保持良好的细胞活性和最高的ε-PL浓度;ε-PL引起的氧化胁迫主要发生在发酵前期,而发酵中后期氧化胁迫的产生主要由酸性p H导致。【结论】提高链霉菌ε-PL发酵过程中的抗氧化胁迫能力,可提升菌体活力和发酵水平。     

核糖体工程技术选育ε-聚赖氨酸高产菌株

【目的】利用核糖体工程技术选育Streptomyces albulus AS3-14的链霉素和利福平双重抗性突变株,以提高其ε-聚赖氨酸合成能力。【方法】通过链霉素抗性筛选,获得链霉素抗性的ε-聚赖氨酸产量提高突变株;在此基础上,继续筛选其利福平抗性突变株,实现链霉素和利福平双重抗性ε-聚赖氨酸高产菌选育。【结果】获得的双重抗性高产突变株Streptomyces albulus WG-608的ε-聚赖氨酸摇瓶产量达到3.7 g/L,5 L发酵罐补料分批发酵ε-聚赖氨酸产量达到53.0 g/L,较出发菌株分别提高了42.3%和32.5%。【结论】链霉素和利福平双重抗性选育能够显著提高ε-聚赖氨酸产生菌Streptomyces albulus的产物合成能力。     

ε-聚赖氨酸产生菌TUST-2的分离鉴定

【目的】ε-聚赖氨酸是一种天然氨基酸同聚物,本研究目的为分离筛选新的ε-聚赖氨酸产生菌。【方法】采用一种新的分离方法从土壤中分离ε-PL产生菌。分离方法含3步:(1)富集培养ε-PL耐受菌;(2)通过改进的Nishikawa方法筛选;(3)挑选高浓度ε-PL耐受菌株。【结果】从海南省土样中分离获得ε-聚赖氨酸产生菌TUST-2。分类和形态特征属链霉菌属。16S rDNA序列分析比对结果表明TUST-2属淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)。经特征反应分析、水解物分析、红外光谱、1H NMR、13C NMR和MALDI-TOF-MS分析表明TUST-2发酵产物为ε-聚赖氨酸。【结论】根据16S rRNA基因序列比对和形态及生理生化特征表明ε-聚赖氨酸产生菌TUST-2属于淀粉酶产色链霉菌,命名为淀粉酶产色链霉菌TUST-2。     

贵州兴义喀斯特洞穴可培养放线菌多样性及抗菌活性初筛

【目的】进一步了解兴义喀斯特洞穴可培养放线菌资源及产活性代谢产物的能力。【方法】选取多种分离培养基,利用稀释直接涂布平板法对贵州黔西南兴义市多个喀斯特洞穴的土壤和岩石进行可培养放线菌资源分离;利用三种发酵培养基对相关放线菌进行生物产物初筛。【结果】根据16S rRNA基因序列的比对分析,将分离得到的251株放线菌分别归类到44个属,其中链霉菌属(Streptomyces)占分离菌株的比例为24.30%,小单孢菌属(Micromonospora)占比11.95%,红球菌属(Rhodococcus)占比9.16%,微杆菌属(Microbacterium)占比7.17%,诺卡氏菌属(Nocardia)占比6.37%,该五类放线菌为该地区可培养放线菌的优势菌群。对70株细菌进行活性次级代谢产物筛选,其中35株放线菌对指示菌具有抑制活性,且主要类群为链霉菌属和小单孢菌属。【结论】贵州兴义喀斯特洞穴中存在丰富多样的放线菌类群,且蕴藏大量具有产生活性次级代谢产物能力的菌株,为医药产业提供潜力菌株资源,极具进一步发掘和研究的价值。     

链霉菌M-Z18膜蛋白ε-聚赖氨酸降解酶的分离纯化、酶学性质及应用

【目的】研究链霉菌Streptomyces sp.M-Z18ε-聚赖氨酸降解酶(Pld)的分离纯化及其生理生化特性,并利用该酶制备低聚合度ε-聚赖氨酸(ε-PL)。【方法】菌体细胞经超声破碎、NaSCN溶解和HiTrapTMButyl HP疏水层析制备到Pld,随后研究了其酶学性质、动力学和降解ε-PL过程,最后利用常量稀释法比较了不同聚合度范围ε-PL的最小抑菌浓度。【结果】从Streptomyces sp.M-Z18细胞膜上分离纯化到Pld,纯化倍数为80.4倍,回收率达到59.3%。以L-赖氨酰对硝基苯胺为底物,酶促反应的最适温度为37℃,最适pH为7.0,动力学常数Km为0.621 mmol/L,Vmax为701.16 nmol/min·mg;酶活在pH 7.0-10.0和50℃以下稳定。降解ε-PL实验发现,纯化到的Pld以内切方式降解ε-PL。抑菌实验表明,高聚合度ε-PL(30-35)对细菌的抑制效果较好,而低聚合度ε-PL(8-20)更有利于抑制酵母菌的生长,各种聚合度ε-PL对霉菌的生长抑制均较差。【结论】从ε-PL产生菌中分离纯化到内切型ε-PL降解酶,发现不同聚合度范围ε-PL对微生物的抑制能力存在显著差异。     

原生质体诱变选育ε-聚赖氨酸高产菌株

以白色链霉菌UN2-71为出发菌株,对其原生质体进行硫酸二乙酯(DES)诱变,选育ε-聚赖氨酸高产菌株。经过试管初筛和摇瓶复筛,得到1株稳定性好的菌株D3-32,摇瓶产量达到1.56g/L,比出发菌株提高49.43%。采用2.3L发酵罐进行发酵试验,控制pH分两阶段培养后,ε-聚赖氨酸最高产量达到4.59g/L,比出发菌株提高了2.65倍。     

ε-聚赖氨酸产生菌新菌株的筛选和产物结构鉴定

通过对Nishikawa的方法进行改进,在广东各地土样中筛选到一株产量为0.846 g/L的新ε-聚赖氨酸(ε-PL)产生菌株,命名为Str-8。对Str-8菌株进行形态、生理生化和16S rDNA分析,初步确定为不吸水链霉菌Streptomyces ahygroscopic。纯化的发酵产物通过水解、质谱、紫外光谱等性质确定为ε-PL。     

报告基因法比较两种放线菌启动子的活性

摘要：【目的】比较启动子Psf与红霉素抗性基因启动子（PermE*）在链霉菌中的表达强度差异。【方法】本文利用卡那霉素抗性梯度以及邻苯二酚2,3-双加氧酶显色系统,比较了两个启动子的表达差异。【结果】两个启动子在棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus) NRRL3585、天蓝色链霉菌（Streptomyces coelicolor）M145,委内瑞拉链霉菌（Streptomyces venezuelae）ISP5230及变铅青链霉菌（Streptomyces lividans TK     

欧洲疮痂链霉菌F5的鉴定及其抗菌活性

【背景】木豆(Cajanus cajan)是一种具有多种药理活性的药用植物,目前对其根际功能放线菌的认识和研究有限,有必要对其应用开发潜力进行研究。【目的】从木豆根际土中筛选一株对植物病原菌和常见病原菌具有广谱拮抗活性的放线菌菌株,鉴定菌株的分类地位、相关代谢产物及可能的生物合成途径,为该菌株的开发应用提供数据支撑。【方法】以7种常见植物病原真菌及8种常见病原菌为指示菌,采用平板对峙法和滤纸片扩散法筛选具有广谱抗菌活性的放线菌菌株,基于形态观察与系统发育分析对该菌株进行分类鉴定,并通过高分辨质谱和超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)对活性菌株的次生代谢产物进行鉴定与验证。采用PCR扩增菌株聚酮合成酶Ⅰ(polyketide synthase,PKS-Ⅰ)和非核糖体多肽合成酶(non-ribosomal peptide synthetase,NRPS)基因,明确其活性代谢产物可能的生物合成途径。【结果】通过抑菌试验筛选得到拮抗放线菌F5,确定其为欧洲疮痂链霉菌(Streptomyces europaeiscabiei),F5菌株基因组中含有编码PKS-Ⅰ和NRPS合成的相关基...     

桑氏链霉菌KJ40全基因组测序及分析

【背景】桑氏链霉菌(Streptomyces sampsonii)KJ40是一株具有防病、促生多重功能的放线菌,有作为生物农药的潜力。目前还没有相关研究报道S.sampsonii全基因组序列,这限制了其功能基因、代谢产物合成途径及比较基因组学等研究。【目的】解析S.sampsonii KJ40的基因组序列信息,以深入研究该菌株防病促生机制及挖掘次级代谢产物基因资源。【方法】利用Illumina HiSeq高通量测序平台对KJ40菌株进行全基因组测序,使用相关软件对测序数据进行基因组组装、基因预测和功能注释、预测次级代谢产物合成基因簇、共线性分析等。【结果】基因组最后得到9个Scaffolds和578个Contigs,总长度为7 261 502 bp,G+C%含量平均为73.41%,预测到6 605个基因、1 260个串联重复序列、804个小卫星序列、67个微卫星序列、90个tRNA、9个rRNA和19个sRNA。其中,2 429、3 765、2 890、6 063和1 911个基因分别能够在COG、GO、KEGG、NR和Swiss-Prot数据库提取到注释信息。同时,还预测得到21个次级代谢产物合成基因簇。基因组测序数据提交至NCBI获得Gen Bank登录号:LORI00000000。S.sampsonii KJ40与Streptomyces coelicolor A3(2)、Streptomyces griseus subsp.griseus NBRC 13350三株链霉菌基因组存在翻转、易位等基因组重排,3个基因组共有1 711个蛋白聚类簇。【结论】研究为从基因组层面上解析KJ40菌株具有良好促生防病效果的内在原因提供基础数据,为深入了解链霉菌次级代谢合成途径提供参考信息,对S.sampsonii后续相关研究具有重要意义。     

植物内生链霉菌Streptomyces sp. SAT1的基因组测序和比较基因组分析

【背景】一直以来,链霉菌都是活性物质的主要生产者,近年来随着抗生素滥用引起的环境和微生物抗药性问题越发严重,挖掘高效生物防治因子和新型抗生素成为了解决以上问题的重要手段。【目的】通过获得植物内生链霉菌SAT1全基因组序列和次级代谢基因簇信息,利用比较基因组学和泛基因组学分析SAT1菌株的特殊性以及与其他链霉菌的共性,为阐明SAT1抑菌和内生机制提供理论基础,为揭示链霉菌的生态功能提供可靠数据。【方法】通过三代测序平台PacBio Sequel完成SAT1基因组测序,利用生物信息学技术进行注释和功能基因分类;分别利用RAxML和PGAP软件进行系统发育树的构建和泛基因组分析;次级代谢基因簇的预测和分析通过antiSMASH网站完成。【结果】获得SAT1菌株的全基因组完成图,该菌线性染色体长度约7.47 Mb,包含有4个质粒,GC含量近73%,共预测到7 550个蛋白编码基因,含有37个次级代谢基因簇,分属29个类型,其中默诺霉素基因簇与加纳链霉菌具有较高相似性。42株代表链霉菌中,单个菌株次级代谢基因簇数量为20-55个,主要类型为PKS类、Terpene类和Nrps类,而且含有大量杂合基因簇,各个菌株中特有基因数目较为庞大。【结论】链霉菌SAT1菌株在基因组特点以及次级代谢基因簇的数量和类型上与其余41株链霉菌具有一定的共性,其中潮霉素B基因簇和默诺霉素基因簇合成的相关物质可能与SAT1抑菌活性密切相关。42株链霉菌中次级代谢基因簇数量的多少与基因组大小成正相关,同时大量杂合基因簇以及庞大的特有基因数目的存在说明链霉菌在长期进化过程中存在了很高程度的水平基因转移现象,可能具有重要的生态功能。     

具有双重抗生素抗性的ε-聚赖氨酸高产菌株选育及生理特性

以ε-聚赖氨酸产量为1.60g/L的Streptomyces albulus M-Z18为出发菌株,利用核糖体工程技术选育具有双重抗生素抗性的ε-聚赖氨酸高产菌株,并对高产菌株和出发菌株的生理生化性能进行比较。通过链霉素诱变成功选育出了1株遗传稳定的ε-聚赖氨酸产生菌S.albulus S-7,ε-聚赖氨酸产量为2.03g/L;对S.albulus S-7叠加巴龙霉素,获得1株遗传稳定的具有双重抗性的ε-聚赖氨酸产生菌S.albulus SP-14,ε-聚赖氨酸产量为2.37g/L,比出发菌株S.albulus M-Z18的ε-聚赖氨酸产量增加了48.10%。使用链霉素和巴龙霉素选育具有双重抗生素抗性的ε-聚赖氨酸高产菌株是一种有效的手段。     

红树林源白骨壤链霉菌中多环稠合大环内酰胺类化合物的结构多样性研究

【目的】通过基因组挖掘的方法,研究红树林来源白骨壤链霉菌Streptomyces avicenniae 9-9中多环稠合大环内酰胺(PTMs)类化合物的结构多样性。【方法】通过生物信息学分析白骨壤链霉菌基因组序列,寻找PTMs类化合物的生物合成相关基因;利用UPLC-MS/MS技术对该菌的次级代谢产物进行分析。【结果】在白骨壤链霉菌基因组中发现PTMs生物合成基因簇(aviA-D);从菌液提取物中鉴定出5个PTMs类化合物,其中包括ikarugamycin(化合物1)和capsimycin B(化合物2);基于PTMs类化合物5-6-5环类型的MS/MS碎裂规律,对化合物3–5的结构进行了推测。【结论】红树林来源白骨壤链霉菌S.avicenniae 9-9具有产生5-6-5环类型的PTMs类化合物的能力。     

ε-聚赖氨酸发酵过程污染微生物的分离与鉴定

【目的】研究ε-聚赖氨酸发酵过程中污染微生物的种类。【方法】采用稀释涂布法、划线法、环境胁迫法和液体营养富集法等对污染样本进行微生物的分离与纯化,通过菌落形态和显微观察,再结合16S rRNA基因序列分析,确定分离菌株的系统发育地位,并对分离菌株的ε-聚赖氨酸耐受性进行考察。【结果】液体营养富集法实现了污染微生物的分离,通过16S rRNA基因序列分析鉴定其为一株Acinetobacter bereziniae,并证实该菌能在高浓度ε-聚赖氨酸条件下生长。【结论】Acinetobacter bereziniae是ε-聚赖氨酸发酵过程中的主要污染微生物,这为后期发酵污染防治提供了一定的指导作用。     

Fostriecin产生菌Streptomyces pulveraceus遗传转化体系的建立与优化

【目的】建立并优化链霉菌Fostriecin产生菌Streptomyces pulveraceus的遗传转化系统。【方法】以整合型质粒pSET152为出发质粒,通过供体菌E.coli ET12567/pUZ8002与受体菌Streptomyces pulveraceus进行接合转移。【结果】确定了链霉菌Streptomyces pulveraceus的最佳接合转移条件:培养基为终浓度含15%甘氨酸的MS培养基;孢子热激条件为50°C 10 min;阿伯拉霉素覆盖的时间为18 h,终浓度为20 mg/L。同时,把组成型启动子ermE+与绿色荧光蛋白基因(gfp)克隆到pSET152载体上,通过接合转移整合到该链霉菌中,gfp获得表达。【结论】建立Fostriecin产生菌的遗传转化系统,并发现甘氨酸能显著提高链霉菌的接合转移效率。     

氧载体对小白链霉菌发酵生产ε-聚赖氨酸的影响

为了有效改善发酵体系中的溶氧水平,提高小白链霉菌Streptomyces albulus PD-1发酵生产ε-聚赖氨酸的能力,文中通过对氧载体的种类、最佳添加浓度以及添加时间进行筛选,最终确定在0 h添加0.5%(V/V)的正十二烷促进ε-聚赖氨酸生产效果最佳。在5 L发酵罐0 h添加0.5%的正十二烷进行批次补料发酵,ε-聚赖氨酸的产量和菌体干重分别可以达到(30.8±0.46)g/L和(33.8±0.29)g/L,较之对照组分别提高了31.6%和20.7%。ε-聚赖氨酸的产量和菌体干重的提高归因于0.5%正十二烷的添加促进发酵液中溶氧水平从23.8%提高到32%,同时发酵液中的一种主要副产物(聚二氨基丙酸)的含量下降31%。实验结果表明,正十二烷的添加可以提高S.albulus PD-1发酵液中的溶氧水平,抑制副产物的生成,促进ε-聚赖氨酸的合成。     

大剂量紫外诱变选育ε-聚赖氨酸高产菌

以白色链霉菌Z-18为出发菌株,经大剂量紫外诱变处理,用S-2-氨基乙基-L-半胱氨酸（AEC）氨基酸结构类似物平板定向育种方法,获得1株ε-聚赖氨酸高产菌C-18,其发酵液中ε-聚赖氨酸产量较出发菌株提高42．9％。在含有50g／L葡萄糖的培养基中,ε-聚赖氨酸积累可达1．23g／L。     

一株海洋放线菌的鉴定及其促生作用机理

【背景】海洋放线菌BM-2是本实验室从连云港海域分离得到的一株具有抗菌和促生作用的优良菌株,具有良好的开发应用前景。【目的】明确海洋放线菌BM-2的分类地位,揭示该菌株的促生作用机理,为菌株的开发应用提供理论依据。【方法】通过形态观察、生理生化特性和16S rRNA基因序列分析,对海洋放线菌BM-2菌株进行种属鉴定;采用透明圈法、平板划线法测定BM-2菌株解磷、解钾作用、固氮作用和产植酸酶、1-氨基环丙烷-1-羧基(1-aminocyclopropane-1-carboxylate,ACC)脱氨酶的能力;运用沙尔科夫斯基反应(Salkowski法)和铬天青(chromeazurol S,CAS)法分别测定菌株产吲哚乙酸(indole acetic acid,IAA)和产铁载体的能力。【结果】培养特征、菌落形态观察及生理生化试验结果表明,BM-2菌株符合链霉菌属(Streptomyces)的特征,16S rRNA基因序列与GenBank中栗褐链霉菌(Streptomyces badius)的序列相似性为99.72%;BM-2菌株具有固氮和解有机磷活性,能够产生ACC脱氨酶、铁载体和IAA。【结论】BM-2菌株为栗褐连霉菌(Streptomyces badius),固氮、解有机磷作用以及产生ACC脱氨酶、IAA可能是该菌株的促生作用机制。     

ε-聚赖氨酸发酵过程的活性变化及发酵调控

摘要:【目的】作为一种次级代谢产物,ε-聚赖氨酸生物合成受不同因素制约,为评价细胞活性对ε-聚赖氨酸生物合成的影响,研究发酵过程细胞活性、ε-聚赖氨酸合成及其它发酵参数变化,基于此改进发酵工艺。【方法】以BacLight Live/Dead和5-氰基-2,3-二甲苯基氯化四唑(5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chloride,CTC) 为荧光探针,激光扫描共聚焦显微镜监测不同发酵时期细胞活性,并分析pH、细胞生长、ε-聚赖氨酸生物合成以及葡萄糖利用;通过向ε-聚赖氨酸合成期细胞添加酵母粉调控细胞活性改进发酵工艺。【结果】BacLight Live/Dead为探针的共聚焦显示ε-聚赖氨酸发酵过程生长期(0－16 h)的细胞大都具有活性;CTC作为探针的分析显示生长期及ε-聚赖氨酸合成期前期(16－30 h)细胞活性高,ε-聚赖氨酸合成终止时细胞仅显示微弱活性;调控ε-聚赖氨酸合成期细胞活性的发酵工艺ε-聚赖氨酸终浓度达2.24 g/L(对照1.04 g/L)。【结论】调控ε-聚赖氨酸合成期细胞活性的发酵工艺可有效促进ε-聚赖氨酸生物合成。     

定殖植物根内和根围放线菌的分离鉴定及其体外抑菌促生效应

【目的】旨在分离、筛选并鉴定体外具抑菌促生作用的定殖于植物根内和根围的放线菌,以期丰富放线菌种质资源,为研制植物病害生防菌剂提供技术依据。【方法】采用稀释涂布平板法分离盐碱地、湿地、工业污染土壤中优势植物根内及其根围中的放线菌;通过平板对峙试验筛选具有抑菌效应的菌株,进而采用Salkowski比色法、CAS平板检测法和无氮源培养法进一步检测抑菌菌株的促生作用;通过形态观测、生理生化特性检测及16SrRNA基因序列分析鉴定菌种。【结果】共分离到链霉菌属(Streptomyces)、诺卡氏菌属(Nocardia)和小单孢菌属(Micromonospora) 3属共283株定殖于植物根内和根围的放线菌,3个采样地中湿地数量最多,均为根围土根内;其中链霉菌属占总数的77%,可分为10个类群。经筛选获得7株抑菌活性和促生效应较强的菌株,其中菌株H6-1抑菌效应最大,其无菌发酵液对尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)、灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)、轮纹大茎点霉(Macrophomakawatsukai)和瓜类炭疽菌(Colletotrichumorbiculare)的抑制率分别为32.3%、42.6%、48%、72.2%、58.1%和60.5%;而D11-4菌株的促生作用最强,能产吲哚乙酸(22.3 mg/L)、产铁载体(晕圈直径25.2 mm)和固氮。经鉴定这7株放线菌是吸水链霉菌变种(Streptomyces angustmyceticus) H4-6、娄彻氏链霉菌(Streptomyces rochei) S2-2、浑圆链霉菌(Streptomycesglobosus)H6-1、(Streptomycesiakyrus)GD8-4、波卓链霉菌(Streptomyces bottropensis) GH8-6、(Streptomyces paradoxus) H8-2和(Streptomyces coralus) D11-4。【结论】三个生境中定殖于植物根内和根围的放线菌类群丰富且所筛选获得的7株放线菌具有生防潜力,值得进一步研发。