核糖体工程技术选育ε-聚赖氨酸高产菌株

【目的】利用核糖体工程技术选育Streptomyces albulus AS3-14的链霉素和利福平双重抗性突变株,以提高其ε-聚赖氨酸合成能力。【方法】通过链霉素抗性筛选,获得链霉素抗性的ε-聚赖氨酸产量提高突变株;在此基础上,继续筛选其利福平抗性突变株,实现链霉素和利福平双重抗性ε-聚赖氨酸高产菌选育。【结果】获得的双重抗性高产突变株Streptomyces albulus WG-608的ε-聚赖氨酸摇瓶产量达到3.7 g/L,5 L发酵罐补料分批发酵ε-聚赖氨酸产量达到53.0 g/L,较出发菌株分别提高了42.3%和32.5%。【结论】链霉素和利福平双重抗性选育能够显著提高ε-聚赖氨酸产生菌Streptomyces albulus的产物合成能力。     

大剂量紫外诱变选育ε-聚赖氨酸高产菌

以白色链霉菌Z-18为出发菌株,经大剂量紫外诱变处理,用S-2-氨基乙基-L-半胱氨酸（AEC）氨基酸结构类似物平板定向育种方法,获得1株ε-聚赖氨酸高产菌C-18,其发酵液中ε-聚赖氨酸产量较出发菌株提高42．9％。在含有50g／L葡萄糖的培养基中,ε-聚赖氨酸积累可达1．23g／L。     

ε-聚赖氨酸高产菌选育与发酵性能评价

【目的】选育ε-聚赖氨酸(ε-PL)高产菌,并探究不同碳源对其发酵性能的影响。【方法】借助基因组重排和核糖体工程两种育种手段强化ε-PL产生菌的合成能力,并利用p H冲击工艺评价不同碳源对ε-PL发酵的影响。【结果】经过4轮基因组重排和4轮核糖体工程连续选育,获得1株高产突变株Streptomyces albulus GS114,其摇瓶ε-PL产量达到3.0 g/L,较出发菌提高了1.7倍。该改造菌株在5 L发酵罐中分别以葡萄糖和甘油为碳源进行192 h的补料-分批发酵时,ε-PL发酵产量分别达到了43.4 g/L和45.7 g/L,较出发菌提高了11.0%和14.9%,而菌体量分别减少了24.0%和33.2%,ε-PL得率提高了34.2%和30.7%。【结论】基因组重排结合核糖体工程育种是一种有效的ε-PL高产菌选育手段,研究结果将为ε-PL高产菌改造和工业生产碳源选择提供直接指导。     

原生质体诱变选育ε-聚赖氨酸高产菌株

以白色链霉菌UN2-71为出发菌株,对其原生质体进行硫酸二乙酯(DES)诱变,选育ε-聚赖氨酸高产菌株。经过试管初筛和摇瓶复筛,得到1株稳定性好的菌株D3-32,摇瓶产量达到1.56g/L,比出发菌株提高49.43%。采用2.3L发酵罐进行发酵试验,控制pH分两阶段培养后,ε-聚赖氨酸最高产量达到4.59g/L,比出发菌株提高了2.65倍。     

一株产ε-聚赖氨酸的白色链霉菌遗传转化体系

为了更好地研究ε-聚赖氨酸(ε-PL)生物合成的分子机制以及构建ε-PL高产基因工程菌株,拟建立一株ε-PL产生菌株Streptomyces albulus PD-1的遗传转化体系。通过对培养基类型、孢子预萌发处理、培养基中Mg2+浓度等条件进行考察,以Escherichia coli ET12567(p UZ8002)为供体菌,成功地将p IB139质粒导入S.albulus PD-1中。结果表明:质粒转化效率达到(3±0.4)×10-6个接合转化子/受体。接合子传代实验和PCR结果发现,p IB139质粒能够稳定整合在S.albulus PD-1染色体的att B位点上。本研究建立了一株ε-PL生产菌株的遗传转化体系,为从分子水平上研究ε-PL的合成及ε-PL高产菌株的构建奠定了基础。     

ε-聚赖氨酸高产改造菌发酵过程分析与工艺改进

ε-聚赖氨酸(ε-PL)是我国新近批准的一种天然食品防腐剂,由链霉菌好氧发酵制备而来。通过传统育种手段强化产生菌ε-PL合成能力是提高其发酵水平的重要途径,然而高产改造菌与出发菌株发生的生理改变却很少被关注。本研究从培养特征,营养需求和发酵过程参数等方面进行比较与分析,发现高产菌株Streptomyces albulus GS114具有需氧量小、菌体量低、ε-PL产量高、单位菌体ε-PL合成能力强、转化率高等特点。为了进一步提高S.albulus GS114的ε-PL产量,通过提高pH冲击策略中预培养p H增加其菌体量,实现ε-PL产量达到53.49 g/L,较优化前提高了11.9%。研究结果将为ε-PL工业化生产奠定基础。     

ε-聚赖氨酸高产菌株的选育

正ε-聚赖氨酸(PL)由链霉菌合成、分泌[1],对细菌、霉菌、酵母菌等有强烈的生长抑制作用,是一种被广泛应用的生物食品防腐剂。但野生型产生菌的ε-PL合成能力都比较低,利用物理和化学诱变,选育S-2-氨基乙基-L-半胱氨酸和甘氨酸抗性突变株,已见报道的最高摇瓶产量为2.11 g/L[2];应用等离子诱变技术和基因组重排技术,可将ε-PL最高摇瓶产量提高到3.11 g/L[3]。但传统的选育手段耗时、耗     

Genome shuffling筛选ε-聚赖氨酸高产菌及其对代谢流量分配的影响

【目的】从代谢流量分配的角度,探讨Genome shuffling导致链霉菌ε-聚赖氨酸合成量提升的原因。【方法】从葡萄糖耐受型的亲本菌株Streptomyces sp.AS32和ε-聚赖氨酸耐受型的亲本菌株Streptomyces albulus F15出发,进行三轮Genome shuffling,筛选得到ε-聚赖氨酸产量提高的链霉菌株Streptomyces sp.AF3-44,采用通量分析方法构建链霉菌ε-聚赖氨酸合成代谢网络,并对上述3株菌的代谢通量进行比较。【结果】AF3-44的ε-聚赖氨酸摇瓶产量为3.1 g/L,较AS32和F15分别提高了34%和29%。3株菌株中AS32三羧酸循环(TCA)的代谢通量最高;F15磷酸戊糖途径(PPP)代谢通量最高;AF3-44流向赖氨酸合成前体天冬氨酸以及ε-聚赖氨酸的通量最高,TCA和PPP通量位于两亲本菌株的中间水平,其中TCA中流向异柠檬酸的通量分别为AS32和F15的77%和116%,PPP中流向5-磷酸核酮糖的通量分别为AS32和F15的149%和92%。【结论】Genome shuffling导致了代谢流的重新分布,流向前体赖氨酸和ε-聚赖氨酸通量的增加,以及PPP和TCA通量配比的改变是链霉菌ε-聚赖氨酸合成量增加的重要因素。     

利用核糖体工程选育丙酮丁醇菌提高丁醇产量

利用核糖体工程技术对丙酮丁醇梭菌Clostridium acetobutylicum L7进行诱变筛选,以获得丁醇高产菌株。使用链霉素诱变C.acetobutylicum L7并结合设计的平板转接逐次提高链霉素浓度的筛选路线,获得丁醇产量较高的菌株S3。结果表明,S3丁醇产量为(12.48±0.03)g/L,乙醇产量为(1.70±0.07)g/L,相对于原始菌分别提高了11.2%及50%;丁醇/葡萄糖转化率由原始菌的0.19提高到0.22,丁醇生产率达到0.24 g/(L.h),相比提高30.5%;耐受丁醇浓度由原始菌的12 g/L提高到14 g/L;发酵液粘度下降到4 mPa/s,同比降低了60%,利于后续分离工作的进行,降低发酵成本。进一步研究工作表明,S3菌株遗传稳定性良好。因此,核糖体工程技术是一种选育丁醇高产菌株的有效方法。     

微波诱变结合抗性突变筛选放线菌素D高产菌株

采用微波结合链霉素抗性筛选法选育放线菌素D的高产菌株。通过考察链霉素对Streptomyces rubiginosohelvolus FIM-N31菌株孢子生长情况的影响确定链霉素致死浓度,出发菌株FIM-N31的孢子经微波辐照处理后,涂布在含链霉素致死浓度（50 μg/mL）的培养基平板上培养,获得了大量的链霉素抗性基因突变株。摇瓶发酵筛选突变株,结果获得一株遗传性状稳定的放线菌素D高产菌Str186,其产放线菌素D的能力比出发菌株提高了8倍以上。     

谷氨酰胺高产菌株的定向选育研究

采用谷氨酸棒杆菌S9114为出发菌株,经γ-射线—硫酸二乙酯—γ-射线诱变,磺胺胍抗性筛选后,定向选育出1株高产菌株SH77。在适宜的条件下积累谷氨酰胺平均为38.9g/L,最大达39.3g/L,比出发林提高了3.81倍。该菌株在最优化代谢控制发酵工艺条件下,谷氨酰胺产量最高达56.2g/L。     

激光与抗性突变筛选技术相结合选育抗肿瘤抗生素博安霉素高产菌株

目的:获得博安霉素高产菌株,同时比较了铜蒸汽激光与妥布霉素抗性及二者复合诱变的选育效果。方法:采用铜蒸汽激光辐照30 min与妥布霉素100 r/m L抗性处理及其复合诱变选育博安霉素产生菌轮枝链霉菌(S.verticillus)B-31。结果:在复合诱变组中,获得一株高产突变株GB-160,经发酵罐应用后,发酵单位较出发菌株提高1.5倍,并且遗传性能稳定。结论:该方法能有效获得抗生素高产优质菌株。在医药生物工程中,具有较高的实用价值,为其它药物微生物选育提供借鉴。     

聚-ε-赖氨酸高产菌株的筛选及其发酵工艺的初步研究

利用亚甲基蓝平板初筛、摇瓶复筛,从土壤中筛选了一株聚-ε-赖氨酸(ε-PL)高产菌株,ε-PL摇瓶产量大于2g/L,经初步鉴定该菌株为白色链霉菌(Streptomyces albulus)。对该菌株发酵生产ε-PL的培养基成分进行初步研究表明:葡萄糖是最好的碳源,酵母粉和硫酸铵是最佳的复合氮源,在优化培养基下,ε-PL摇瓶产量达到3.9g/L。     

种间原生质体融合提高巴龙霉素单位产量的研究

将巴龙霉素产生菌与新霉素产生菌的高产变株进行了种间原生质体融合,融合频率为10^-4左右。在4l0株稳定的原养型重组体中,产生巴龙霉素者占58％。在200株产生巴龙霉素的种间重组体中,单位产量在1500μg／ml以上的约10％,获得了比巴龙霉素产生菌原始菌株(单位产量300μg／ml)单位产量高5—6倍的重组体菌株。核磁共振谱和质谱测定证明,高单位重组体所产抗生素确为巴龙霉素。结果表明,为了提高某一抗生素产生菌的单位产量,使之与另一生物合成途径相似的抗生素产生菌的高产变株进行种间杂交,是一值得探索的新途径。     

ε-聚赖氨酸高产菌株选育及分批发酵的研究

以北里孢菌(Kitasatospora sp.)PL6-3为出发菌株,经硫酸二乙酯诱变,获得遗传性能稳定的AECr突变株MY5-36。MY5-36摇瓶发酵产ε-聚赖氨酸达1.17 g/L,是出发株PL6-3的3倍;5 L发酵罐批式发酵产酸达7.72 g/L,较出发菌株提高了7倍以上。与PL6-3相比,MY5-36菌株形态发生了很大变化,菌丝和孢子颜色都发生了改变。     

链霉菌Streptomyces sp. M-Z18转化前体L-赖氨酸合成ε-聚赖氨酸的研究

目的:考察不同细胞培养方式对Streptomyces sp. M-Z18转化前体L-赖氨酸合成ε-聚赖氨酸过程的影响。方法:利用两阶段细胞培养和发酵过程流加方式,建立了两阶段细胞培养转化前体L-赖氨酸合成ε-聚赖氨酸以及转化前体L-赖氨酸耦合甘油发酵生产ε-聚赖氨酸的策略。结果:(1)两阶段细胞培养转化前体L-赖氨酸合成ε-聚赖氨酸策略实现ε-PL积累15 g/L, 转化L-赖氨酸3 g/L;(2)转化前体L-赖氨酸耦合甘油发酵生产ε-聚赖氨酸策略使得ε-PL产量达到33.76 g/L,单位菌体的合成能力提高37.8%,转化L-赖氨酸4 g/L。这表明,上述两种方式下前体L-赖氨酸都能够被Streptomyces sp. M-Z18转化合成ε-聚赖氨酸,但转化效率还有待进一步提高。意义:揭示了Streptomyces sp. M-Z18合成ε-聚赖氨酸的限速步骤在于初级代谢产物L-赖氨酸的合成,这为后续利用代谢工程手段改造菌株提供了方向。     

氧载体对小白链霉菌发酵生产ε-聚赖氨酸的影响

为了有效改善发酵体系中的溶氧水平,提高小白链霉菌Streptomyces albulus PD-1发酵生产ε-聚赖氨酸的能力,文中通过对氧载体的种类、最佳添加浓度以及添加时间进行筛选,最终确定在0 h添加0.5%(V/V)的正十二烷促进ε-聚赖氨酸生产效果最佳。在5 L发酵罐0 h添加0.5%的正十二烷进行批次补料发酵,ε-聚赖氨酸的产量和菌体干重分别可以达到(30.8±0.46)g/L和(33.8±0.29)g/L,较之对照组分别提高了31.6%和20.7%。ε-聚赖氨酸的产量和菌体干重的提高归因于0.5%正十二烷的添加促进发酵液中溶氧水平从23.8%提高到32%,同时发酵液中的一种主要副产物(聚二氨基丙酸)的含量下降31%。实验结果表明,正十二烷的添加可以提高S.albulus PD-1发酵液中的溶氧水平,抑制副产物的生成,促进ε-聚赖氨酸的合成。     

紫外诱变选育恩拉霉素高产菌株

本研究采用紫外诱变育种技术对一株产恩拉霉素抗真菌链霉菌(Streptomyces fungicidicus)F110进行了诱变处理,经链霉素抗性、利福霉素B抗性以及双重抗性筛选,共获得了132株抗生素抗性突变株,其中26株突变菌株的恩拉霉素产量与出发菌株相比均有明显提高。摇瓶发酵条件下,突变株SR93的恩拉霉素产量最高可达2 400μg/m L,与出发菌株相比提高了38%。传代结果表明:该突变株产素水平稳定,因此具备较好的开发及工业应用价值。     

Breeding of ε-poly-L-lysine producing strain using succinic acid as sole carbon source

本文旨在通过诱变和耐受性筛选的手段提高放线菌ε-PL的产量.以稠李链霉菌Streptomyces padanus LS-L5为出发菌,经紫外诱变,在以琥珀酸为唯一碳源的培养基上筛选快速生长的菌株,测定突变株的ε-PL发酵水平和遗传稳定性.经初筛和复筛,获得突变株H3,其摇瓶发酵ε-PL产量为0.68 g/L,较出发菌提高了41％,传代4次产量基本稳定.H3在5L发酵罐中分批发酵,ε-PL产量达到2.0 g/L,较出发菌提高了一倍.在固定二氧化碳的能力方面,突变株H3的PEP羧化酶酶活较出发菌株LSL5的PEP羧化酶酶活提高了1.67倍.     

农用抗生素TS99高产菌株的选育

在明确链霉素对农抗TS99产生菌Streptomyces fungicidicus YH04孢子的致死浓度为1.2μg/mL的基础上,以链霉素致死浓度为选择压力,采用不同剂量的紫外线照射对菌株孢子进行诱变处理,获得了大量的链霉素抗性基因突变株,进而从中筛选到发酵效价较出发菌株提高60%以上,且遗传稳定性良好的高产菌株Streptomyces fungicidicus YH9407.