苏北地区规模化猪场产肠毒素大肠杆菌的分离鉴定及灭活疫苗效果评估

[目的]产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)是引起仔猪腹泻的重要病原菌,本研究通过调查苏北地区规模化猪场ETEC的流行情况,分析其生物学特性,研制具有免疫保护效果的优势血清型菌株的灭活疫苗,以期对苏北地区ETEC的防控提供参考。[方法]从苏北地区规模化猪场采集3-30日龄的仔猪新鲜粪样、肛拭子及小肠组织样,分离出ETEC,对分离菌株进行血清型鉴定、耐药性测定、小鼠致病力测定;最后通过动物免疫试验研究优势血清型菌株灭活疫苗对小鼠的免疫保护效果。[结果]从21个规模化猪场采集病料562份,通过PCR鉴定及测序得到141株ETEC;血清凝集试验鉴定出85株菌的O抗原血清型,其中08、0101和0128为优势血清型,占定型菌株的61.2%(52/85),其他血清型包括09、03、020、0148、0149等;分析141株ETEC对14种常见抗生素的耐药情况,得出分离株对新霉素、红霉素、四环素、庆大霉素、强力霉素、阿莫西林、甲氧苄啶/磺胺甲恶唑高度耐药,耐药率均高达80%以上;对恩诺沙星敏感性较高,敏感率达50.4%(71/141);对多粘菌素B和头孢噻肟中介耐药,占比分别为66%(93/141)和51.8%(73/141);多重耐药现象严重,其中10重耐药的菌株占比最大,为19%(27/141);小鼠攻毒试验测得08血清型强毒株YC-6的半数致死量(median lethal dose,LD50)为1.4×10^7 CFU/只,最低致死量(minimum lethal dose,MLD)为3×10^7 CFU/只;08血清型强毒株YC-6和0101血清型强毒株LYG-3制备的单价灭活疫苗对小鼠的保护率均达到100%,因此利用08血清型强毒株YC-6和0101血清型强毒株LYG-3研制二价灭活疫苗,结果显示该二价疫苗对感染不同血清型ETEC小鼠的保护率在83%以上。[结论]本研究通过对苏北地区ETEC的流行病学调查,得出其优势血清型,并研制出针对对优势血清型免疫保护效果较好的二价灭活疫苗,给临床ETEC的监测和防控提供参考。     

大肠杆菌O157:H7噬菌体鸡尾酒喷雾干燥微囊粉剂的制备及其应用

【目的】提高噬菌体在常温环境下的保存稳定性,解决噬菌体鸡尾酒在体内失活的问题,为噬菌体对肠道疾病的治疗提供参考依据。【方法】本研究采用喷雾干燥技术制备噬菌体鸡尾酒微球粉末,通过单因素试验和正交试验确定最佳制备条件,并对其特性进行研究,比较其与游离噬菌体在常温环境和体内环境的稳定性差异,并通过口服给药的方式对大肠杆菌(Escherichia coli)O157:H7导致的肠道疾病进行治疗。【结果】本研究以海藻糖和亮氨酸组合为保护剂制备了一种具有热稳定性的噬菌体鸡尾酒微球粉末,试验结果显示,海藻糖和亮氨酸质量比为9:1时,设置进料速度为7.5 mL/min、海藻糖浓度为2%、入口温度为130℃、噬菌体鸡尾酒悬液与保护剂溶液体积比为1:50,噬菌体滴度损失最小,仅下降(0.623±0.235)log10 PFU/g。其在常温条件下保存6个月,噬菌体鸡尾酒滴度损失(0.862±0.082)log10 PFU/g,较游离噬菌体具有更长的保存稳定性,且其于体内环境的稳定性和治疗效果均优于游离噬菌体鸡尾酒。【结论】采用喷雾干燥法配合合适的保护剂配方可制得具有生物活性和热稳定性的噬菌体鸡尾酒微球粉末,延长其保质期,便于常温条件下的保存运输,使噬菌体制剂从实验室方向转化为工业方向的规模化生产提供参考依据。且噬菌体微球粉末清除肠道内大肠杆菌的能力更强、速度更快,是一种具有体内治疗发展潜力的口服给药剂型。     

太湖地区绿肥还田模式下氮肥的深度减量效应

通过绿肥还团条件下免施基肥的氮肥深度减量试验,研究了稻季田面水氮素含量、氮素径流损失及水稻产量的变化.结果表明:在太湖地区绿肥还田模式下,追施150 kg·hm-2无机氮,与施基肥相比,不施基肥可以大大降低田面水的氮素浓度,减少了17.2％的氮素径流流失,且作物产量提高了2.8％.无机氮肥仅作追肥的施肥方式是可行的,但过量减施或增施无机氮肥均不能获得最高的产量.在太湖地区尝试紫云英还田条件下免施基肥,同时补充133kg·hm-2无机氮作追肥,既可以大大减少无机肥的投入、保证水稻产量,也可以减少稻田氮素的排放量,实现水稻产量效应和环境效应的协调.     

荧光标记噬菌体快速检测K1荚膜大肠杆菌方法的建立及应用

【背景】大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)是引发新生儿脑膜炎和禽类脑膜炎最常见的革兰氏阴性菌,其中含K1荚膜大肠杆菌是重要的病原菌。目前,K1荚膜大肠杆菌的检测方法存在一些弊端。【目的】利用PNJ1809-36噬菌体的宿主特异性建立快速检测K1荚膜大肠杆菌的方法。【方法】用荧光染料SYBR Gold标记PNJ1809-36噬菌体,侵染33株受试菌,在荧光显微镜下观察,测定该方法的特异性;倍比稀释宿主菌DE058,用荧光标记噬菌体侵染,测定该方法的灵敏度;用荧光标记噬菌体检测8份模拟粪样,测定该方法的临床应用效果;测定4℃避光保存4个月的荧光标记噬菌体的效价和检测效果。【结果】33株受试菌中的9株K1荚膜大肠杆菌有8株可见环状荧光,1株未能检出;20株非K1荚膜大肠杆菌以及4株非大肠杆菌属细菌均不能观察到荧光,检测灵敏度达100CFU/mL。8份模拟粪样的检测结果显示,3份含有K1荚膜大肠杆菌的粪样均可见环状荧光,5份不含K1荚膜大肠杆菌的粪样均无荧光。荧光标记噬菌体4℃避光保存4个月后效价无明显下降,检测效果无明显变化,表明该荧光标记噬菌体在4℃避光条件下较稳定。【结论】用荧光标记的PNJ1809-36噬菌体能够在15min内特异、快速、直观地检测K1荚膜大肠杆菌。     

一株分离自流浪猫的猪链球菌9型的分子生物学鉴定北大核心CSCD

【目的】猪链球菌是一种能感染人和猪的人畜共患病病原,并且还可零星感染多种哺乳动物。本试验旨在调查流浪猫携带猪链球菌的情况。【方法】在流浪猫身上分离猪链球菌,经血清凝集实验和PCR检测,鉴定其血清型;经多序列位点分型分析,鉴定其ST型;将所分离的细菌与Gen Bank上已公布的猪链球菌构建16S rRNA的系统发育树,分析该菌株与其他猪链球菌的亲缘关系;药敏纸片法分析其耐药性;小鼠攻毒试验分析其毒力。【结果】本试验在流浪猫身上分离到一株猪链球菌,命名为m70,其血清型为9型。多序列位点分型显示,m70株属于一个新的ST型。与Gen Bank上已公布的猪链球菌16S rRNA进行系统发育树分析,结果显示m70属于一个单独的分支。m70与临床菌株的耐药情况相似,对四环素耐药,对红霉素中介耐药,对氨苄西林敏感。小鼠攻毒试验显示,感染10~8 CFU剂量m70的小鼠,死亡率达到60%–80%（3/5–4/5）,3次攻毒试验的平均LD（50）为5.1×107 CFU;而本实验室保存的猪链球菌强毒株HA9801感染小鼠的平均LD（50）为3.9×107 CFU,两者之间没有显著差异（P〈0.05）。【结论】从流浪猫身上分离得到的猪链球菌m70属于优势血清型,且毒力较强,提示一些流行血清型的猪链球菌强毒株具有从流浪猫传染人的潜在风险。     

猪链球菌的烈性噬菌体和前噬菌体

猪链球菌(Streptococcus suis,S.suis)是一种重要的人畜共患病病原,携带有前噬菌体。本文对猪链球菌的烈性噬菌体和前噬菌体的研究现状做了综述,主要包括猪链球菌烈性噬菌体的形态及功能;烈性噬菌体裂解酶的结构及功能;烈性噬菌体末端酶大亚基的活性;前噬菌体的比较基因组学、前噬菌体的裂解酶以及烈性噬菌体和溶原性噬菌体之间的相互转化,并对猪链球菌噬菌体与宿主的相互关系作了展望。     

副溶血弧菌Ⅲ型分泌系统vscG基因缺失株的构建及其生物学特性

【背景】副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一种重要的食源性病原微生物,Ⅲ型分泌系统(TypeⅢSecretionSystem,T3SS)在致病过程中发挥重要作用。vscG基因编码的Vsc G蛋白是Ⅲ型分泌系统的伴侣蛋白。vscG基因在副溶血弧菌中的生物学功能尚未确定。【目的】构建副溶血弧菌vscG基因的缺失株和回补株,研究vscG基因对副溶血弧菌生物学特性的影响。【方法】在副溶血弧菌POR-1菌株基础上利用同源重组法构建vscG基因的缺失株ΔvscG和回补株CΔvscG,分析比较POR-1、ΔvscG和CΔvscG在生长性能、生物被膜形成能力、运动性、溶血活性、细胞黏附和细胞毒性等方面存在的差异。【结果】与POR-1菌株相比,缺失株ΔvscG和回补株CΔvscG的生长特性和溶血活性无明显差异,缺失株ΔvscG的生物被膜形成能力下降,运动性较POR-1菌株和回补株CΔvscG增强。细胞感染试验显示,vscG基因的缺失明显降低了副溶血弧菌对HeLa细胞的黏附和毒性作用。【结论】vscG基因影响副溶血弧菌生物被膜的形成和运动性,在该菌黏附细胞和发挥细胞毒性过程中具有重要作用,为进一步探讨副溶血弧菌T3SS的致病机理奠定基础。     

vcrV基因对副溶血弧菌生物学特性及III型分泌系统1效应蛋白易位的影响

【背景】副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)具有两套III型分泌系统(typeIIIsecretion system,T3SS)。T3SS1通过向宿主细胞分泌效应蛋白发挥致病作用,vcrV基因位于T3SS1编码基因簇。【目的】以vcrV基因为研究对象,探索其对副溶血弧菌生物学特性及T3SS1致病机制的影响。【方法】以副溶血弧菌POR-1株为参考菌株,利用同源重组技术构建vcrV基因缺失株ΔvcrV和回补株CΔvcrV,比较各菌株在生长性能、生物被膜形成能力、细胞黏附及细胞毒性等生物学特性的差异,应用Western Blot检测T3SS1诱导条件下POR-1、ΔvcrV和CΔvcrV等菌株效应蛋白分泌量,进一步利用具有过表达载体pMMB207-vp1683-CyaA的各菌株侵染HeLa细胞,通过Western Blot检测细胞内效应蛋白VopR(Vp1683)的易位量。【结果】与基础菌株POR-1相比,缺失vcrV基因不影响副溶血弧菌的生长性能、生物被膜形成能力及细胞黏附等生物学特性,显著降低了对HeLa细胞的毒性作用,具有过表达载体的POR-1、ΔvcrV和CΔv...     

大肠杆菌O157:H7噬菌体鸡尾酒喷雾干燥微囊粉剂的制备及其应用

【目的】提高噬菌体在常温环境下的保存稳定性,解决噬菌体鸡尾酒在体内失活的问题,为噬菌体对肠道疾病的治疗提供参考依据。【方法】本研究采用喷雾干燥技术制备噬菌体鸡尾酒微球粉末,通过单因素试验和正交试验确定最佳制备条件,并对其特性进行研究,比较其与游离噬菌体在常温环境和体内环境的稳定性差异,并通过口服给药的方式对大肠杆菌(Escherichiacoli)O157:H7导致的肠道疾病进行治疗。【结果】本研究以海藻糖和亮氨酸组合为保护剂制备了一种具有热稳定性的噬菌体鸡尾酒微球粉末,试验结果显示,海藻糖和亮氨酸质量比为9:1时,设置进料速度为7.5 mL/min、海藻糖浓度为2%、入口温度为130℃、噬菌体鸡尾酒悬液与保护剂溶液体积比为1:50,噬菌体滴度损失最小,仅下降(0.623±0.235) log10 PFU/g。其在常温条件下保存6个月,噬菌体鸡尾酒滴度损失(0.862±0.082) log10 PFU/g,较游离噬菌体具有更长的保存稳定性,且其于体内环境的稳定性和治疗效果均优于游离噬菌体鸡尾酒。【结论】采用喷雾干燥法配合合适的保护剂配方可制得具有生物活性和热稳定性的噬菌体鸡尾酒微球粉末...