成年大鼠阴茎海绵体cajal间质细胞的分离、培养与鉴定

目的:探索成年大鼠阴茎海绵体内cajal间质细胞(ICCs)的分离、培养和鉴定方法,为进一步研究其在阴茎海绵体中的作用提供条件.方法:取大鼠阴茎海绵体组织,采用酶消化法分离细胞,差速贴壁法相对纯化ICCs,将纯化后的细胞悬液接种于DMEM培养基中进行培养.通过倒置显微镜下观察细胞贴壁和形态,并用c-Kit特异性抗体标记细胞,免疫荧光法鉴定ICCs.结果:培养24小时后ICCs贴壁良好,细胞形态学观察显示ICCs呈纺锤状,有两个或多的突起,免疫荧光检验可见ICCs呈c-Kit抗体染色阳性.结果:用酶消化法可成功分离和培养大鼠阴茎海绵体ICCs,大鼠海绵体组织内ICCs的生理学功能有待进一步研究.     

大鼠少突胶质前体细胞(OPCs)纯化培养及糖氧剥夺(OGD)模型的建立

目的建立大鼠脑少突胶质前体细胞(oligodendrocyte precursor cells,OPCs)分离纯化培养及糖氧剥夺(oxygen glucose deprivation,OGD)模型。方法出生3d内的SD大鼠乳鼠取脑,经胰蛋白酶消化法培养混合胶质细胞,混合培养10d后,震摇及差速贴壁法分离纯化OPCs,纯化培养3d后鉴定、诱导分化OPCs为少突胶质细胞(oligodendrocyte,OL)及进一步OGD干预。免疫荧光法鉴定OPCs纯度及分化为OL的能力;MTT法检测OGD(37℃,1%O2,5%CO2)干预0.5h、1h、2h及4h时细胞活力改变,Edu染色检测细胞增殖情况。结果免疫荧光显示纯化培养的OPCs 95%以上表达NG2+A2B5,且可分化为MBP阳性的OL。OGD 2h时,MTT显示细胞活力明显下降,Ed U染色阳性率明显降低。结论震摇及差速贴壁法可获得高纯度的OPCs,且细胞具有分化为OL的能力。2h可作为OPCs OGD模型缺血缺氧损伤合适时间。     

人早孕胎盘绒毛膜滋养层细胞体外培养模型的建立

目的通过对早孕胎盘绒毛膜滋养层细胞的分离,纯化和培养,寻找一种稳定、简便可获得较高纯度滋养层细胞的培养方法。方法通过胰酶/DNA酶联合消化法对妊娠6-10周绒毛组织进行消化,获得单细胞悬液,比较Per-coll密度梯度离心和淋巴细胞分离液对滋养层细胞的分离纯化效果。含10?S的DMEM/F12培养基培养,并比较是否应用鼠尾胶原对细胞贴壁和生长的影响。通过免疫荧光方法对滋养层细胞进行鉴定。结果经简化Percoll密度梯度离心分离纯化的滋养层细胞纯度高,明显优于淋巴细胞分离液的分离效果(P<0.001);细胞生长表面预先经鼠尾胶原处理后,细胞贴壁良好,分裂生长旺盛。结论利用简化Percoll密度梯度离心法分离细胞,并在应用鼠尾胶原的条件下进行培养,可以获得满意的人绒毛膜滋养层细胞的体外培养模型。     

成年SD大鼠心肌原代成纤维细胞分离及培养的优化方案

目的:摸索及优选成年SD大鼠心肌原代成纤维细胞的体外分离、培养及鉴定的实验方法。方法:将成年SD大鼠心脏剪成小组织块,采用以下四种方案(A:0.08%胰酶+0.1%胶原酶II消化15 min,B:0.2%胶原酶II消化15 min,C:0.2%胶原酶II消化60min,D:0.2%胶原酶II消化90 min)提取成年大鼠心脏原代成纤维细胞,再通过差速贴壁分离方法培养原代成纤维细胞。采用倒置显微镜观察成纤维细胞的基本形态特征,并进行Vimentiin免疫荧光染色对培养的原代细胞进行荧光鉴定;采用台盼兰染色对培养的原代成纤维细胞存活率进行鉴定;采用细胞计数对培养的成纤维细胞生长趋势进行鉴定。结果:四种方法均能培养成纤维细胞,但单酶消化60 min可一次性提取较多细胞,并且细胞状态佳,3 d即可传代。72 h成纤维细胞Vimentin免疫荧光染色阳性率高达97%。台盼兰染色可见其细胞死亡率明显降低,并且细胞计数可见细胞生长状态极佳。结论:单酶消化60 min是提取成年SD大鼠心肌原代成纤维细胞的高效、快速、稳定的实验方法,为心脏疾病的基础及临床研究提供了较为理想的细胞学实验模型。     

大鼠应激耐受多系分化细胞的分离、扩增改良技术

目的 探讨体外从大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）中分离应激耐受多系分化细胞（Muse cells）及其扩增培养的技术方法.方法 分离、扩增、鉴定BMSCs,应用长时间应激方法酶消化分离Muse细胞,悬浮扩增培养4d后Western blot鉴定特异性抗原.结果 第3代生长良好的BMSCs中表达CD29、CD90而不表达CD45的占细胞总数的97.89%.长时间酶消化结合悬浮培养后,以酶消化8h组细胞表达CD105显著高于其余各组（P〈0.05）,符合Muse细胞特征.结论 Muse细胞可由BMSCs经消化分离扩增获得,可望为其进一步研究应用奠定基础.     

胚胎大鼠背根神经节细胞的分离培养、纯化及生物学特性的研究

本实验取E15 SD胎鼠的背根神经节,用胰蛋白酶消化分离成单细胞,在NBl培养基中培养,并通过差速贴壁法进行背根神经节神经元(DRGn)的分离纯化,用神经元特异性的烯醇化酶(NSE)鉴定培养的神经元。结果发现DRGn在体外合适条件下可存活3-4周,DRGn纯化培养的纯度达91％左右。DRGn在体外能存活较长时间,可作为神经科学研究的细胞模型。     

实验兔骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定

探讨建立兔骨髓间质干细胞(BMSCs)的体外分离纯化、扩增和鉴定的方法,为BMSCs的进一步诱导分化和应用奠定基础。首先抽取兔髂骨骨髓,采用Percoll密度梯度离心法得到骨髓单个核细胞,接种后形成单层贴壁细胞,经胰蛋白酶消化后传代培养扩增,倒置相差显微镜观察细胞生长状态,细胞免疫组化检测CD73、CD34。结果表明,成功建立了兔BMSCs体外分离及培养扩增的方法,发现BMSCs表现贴壁生长,P0代时呈集落生长,细胞呈梭形,传代后细胞增殖速度加快,形态开始多样化;细胞免疫组化显示BMSCs表达CD73,未表达CD34,反复传代后CD73表达效率增高。上述研究表明,Percoll密度梯度离心联合骨髓贴壁法,能有效分离、纯化和扩增BMSCs,提取的细胞具有BMSCs的生长特性和抗原表型,其中P3~P6代细胞增殖能力强,可用于进一步的研究工作。     

兔骨髓间充质干细胞的分离、培养与鉴定

目的:寻求家兔骨髓间充质干细胞(Bone Mesenchymal Stem cells,BMSCs)培养与分离简单易行的方法,为下一步骨髓间充质干细胞在呼吸系统疾病的应用打好基础。方法:取3个月龄家兔1只,经双侧髂前上棘抽取骨髓共5.0 ml,密度梯度离心法和贴壁筛选法相结合分离、纯化获得BMSCs,倒置差显微镜观察其形态学特性,流式细胞仪鉴定CD34、CD133表达。结果:接种细胞于24小时有少量细胞贴壁,72小时多数细胞可贴壁,贴壁细胞形态多为长梭型或多边形,原代细胞呈集落生长,12-16天可达90%融合,1%胰酶消化后传代培养,培养至第三代备用。流式细胞仪鉴定90%为骨髓间充质干细胞。结论:通过密度梯度离心法与贴壁筛选法可成功分离培养出骨髓间充质干细胞,此方法简单易行,成功率比较高。     

胎盘间充质干细胞的体外培养及其生物学特性研究

目的：探讨胎盘间充质干细胞（PMSCs）的体外分离和培养方法,建立稳定的PMSCs体外培养扩增体系。方法：将胎盘组织经胶原酶消化、密度梯度离心、贴壁筛选法分离,获得并培养人PMSCs,观察细胞形态及其超微结构;应用流式细胞术测定细胞周期及CD14、CD29、CD34、CD44、CD45的表达,研究其增殖和生长特性。结果：在体外培养条件下,人PMSCs贴壁生长,为成纤维细胞样,与骨髓间充质干细胞相似;CD14/CD34/CD45阴性,CD29/CD44阳性,核浆比大,细胞周期检测G0/G1期约占95%,具有原始细胞的特征。结论：体外获得的PMSCs形态单一、生长稳定、增殖能力较强,具有与骨髓间充质干细胞相似的细胞形态、表面标志。由于其来源方便、丰富,无伦理学限制,因此可进一步用于细胞治疗的研究。     

胎肝滤液诱导大鼠胎盘间充质干细胞向肝细胞的分化

目的探讨PDMSCs向肝细胞增殖和分化的体外培养条件及方法。方法孕20 d的大鼠无菌条件下取胎盘,经胶原酶消化、密度离心、贴壁筛选法分离培养胎盘源间充质干细胞,并对其表面抗原进行鉴定。在体外培养体系中加入胎肝滤液,模拟体内肝脏微环境,诱导PDMSCs向肝细胞定向分化,以免疫细胞化学检测干细胞标志物;PAS检测糖原表达。结果在体外培养条件下,PDMSCs贴壁生长为成纤维样细胞,CD44表面标志物检测阳性;PDMSCs经胎肝滤液诱导14d时细胞呈现圆形、卵圆形的特征性改变,AFP、CK19表达阳性。结论胎肝滤液能够诱导PDMSCs定向分化为肝细胞样细胞。     

SD大鼠原代胰岛细胞分离、纯化及培养技术的改进

目的:探讨大鼠胰岛细胞分离、纯化及培养的方法,并评价其生物学功能。方法:选用8~10周龄健康SD大鼠,采用胆总管逆行注射预冷胶原酶P溶液,37℃水浴静止消化,30目不锈钢筛网过滤,Ficoll400非连续密度梯度离心纯化。分离后的胰岛用DTZ染色计算胰岛产量,胰岛素释放试验评价其生物学功能。结果:胰岛细胞分布于Ficoll400浓度为23%~20%和20%~11%的界面之间。DTZ染色呈红色细胞团,胰岛产量为(606±56)IEQ/胰腺。纯度高达80~90%,活率≥90%,胰岛素释放功能良好。结论:胶原酶P溶液原位消化,Ficoll400纯化是一种高效简便的胰岛分离方法,分离的胰岛细胞数量多、纯度高及活性好。     

人VEGF165基因转染成人成肌细胞的实验研究

目的：将人血管内皮生长因子165（hVEGF165）导人原代离体成肌细胞,观察该细胞hVEGF分泌情况,探讨成人自体转基因成肌细胞移植的可行性。方法：采用两步消化法对成人骨骼肌组织消化获取相对较纯的成肌细胞,通过差速贴壁法进行进一步的纯化。以脂质体转染法将pcDNA3．1-hVEGF165导入成肌细胞,通过RT—PCR、ELISA和Western-blot进行hVEGF165定量检测,MTT测定和Mile’s实验检测VEGF165的生物学活性。结果：转基因细胞经RT—PCR扩增出一条VEGF的特异性泳带,ELISA显示转基因细胞培养上清VEGF浓度分别达到18．92±1．77rig／mL、19．04±2．15ng／mL,Western blot检测转基因成肌细胞上清均检测到VEGF蛋白特异性的杂交带,MTT显示转基因细胞上清明显促内皮细胞增殖,Mile’s实验显示转基因细胞上清明显增加毛细血管通透性。结论：质粒pcDNA3．1-hVEGF165能成功转入成人成肌细胞,转基因细胞能分泌有生物活性的VEGF165蛋白。     

全程综合护理干预对提高心肌梗死患者依从性及预后的研究

目的:探讨全程综合护理干预对心肌梗死患者遵医行为及预后的影响.方法:100例心肌梗死患者随机分为对照组及全程综合护理组,每组各50例.对照组实施传统的常规护理,综合护理组患者开展全程综合护理.出院随访1年,1年后复查冠状动脉造影,比较期间服药日比率和心血管事件发生率.结果:全程综合护理干预提高患者服药日比率(81.1±6.2％vs.60.9±5.9％,P＜0.05),并减少患者心肌梗死及PCI术后再狭窄等心血管事件的发生(P＜0.05).结论:全程综合护理干预可提高心肌梗死患者遵医行为,降低二次心梗和冠状动脉再狭窄等心血管事件发生率,改善了患者的预后,为心梗患者的护理提供了新思路.     

老年手术患者应用丙泊酚复合瑞芬太尼喉罩麻醉的临床效果观察

目的：探讨靶控输注丙泊酚复合瑞芬太尼喉罩麻醉在老年手术患者中的临床应用效果,为临床麻醉提供参考。方法：选取127例老年手术患者作为研究对象,随机分为A、B、C3组,A组43例（采用瑞芬太尼复合丙泊酚麻醉,喉罩通气）、B组42例（采用丙泊酚麻醉,喉罩通气）,C组42例（采用瑞芬太尼复合丙泊酚麻醉,面罩通气）,均采用靶控输注静脉麻醉法。观察麻醉诱导时间、术中反应、麻醉效果、镇静效果评分、苏醒时间、认知功能以及不良反应发生率等指标。结果：丙泊酚总用量：A组为（335．2±56．4）mg,B组为（466．5±64．8）mg,C组为（334．8±59．7）mg,经方差分析,差异有统计学意义,F=6．513,P〈0．05;Ramsay评分：A组6分的例数为37例（86．0％）,B组为30（71．4％）,C组为34（81．0％）,经卡方检验,差异有统计学意义,X^2=5．832,P〈0．05;不良反应发生率：A组为5例（11．6％）,B组为15例（35．7％）,C组为7例（16．7％）,经卡方检验,差异有统计学意义,X^2=7．546,P〈0．05。结论：老年手术患者应用丙泊酚复合瑞芬太尼喉罩麻醉效果显著,安全有效。     

小鼠外胎盘锥次级滋养层巨细胞的分离、培养与鉴定

目的：建立小鼠外胎盘锥次级滋养层巨细胞的分离、培养方法.方法：在小鼠妊娠第8 d,通过机械分离和组织块翻转干涸法分离、培养小鼠外胎盘锥次级滋养层巨细胞;免疫细胞化学鉴定细胞来源与纯度;酶谱方法检测其所分泌基质金属蛋白酶2和9（matrix metalloproteinase-2,9,MMP-2,9）结果：利用机械分离法分离外胎盘锥可生长于Matrigel包被的培养板上,并生长出次级滋养层巨细胞,表达特异性标志物Cytokeratin;体外培养24 h、48 h后,外胎盘锥滋养层巨细胞的粘附率分别为（83.3±9.1）%和（92.4±7.3）%;扩展率分别为（45.5±5.3）%和（56.4±6.8）%;及其所分泌的MMP-2,9的24 h光密度值分别为（87±4.7）和（351.5±25.2）;48 h分别为（186±40.2）和（556.5±61.5）.结论：采用机械分离和组织块翻转干涸法,可简单、快捷地获得高纯度小鼠外胎盘锥次级滋养层巨细胞.     

1-磷酸鞘氨醇对心肌细胞钾离子通道的作用

目的：研究1-磷酸鞘氨醇（S1P）对豚鼠心室肌细胞延迟整流钾电流（IK）、内向整流钾电流（IK1）的作用。方法：实验用胶原酶酶解法急性分离豚鼠心室肌细胞,利用全细胞膜片钳的方法记录心室肌细胞的延迟整流钾电流（IK）、内向整流钾电流（IK1）。结果：①应用S1P（1．1μmol／L）后IK从（1．24±0．26）nA降至（0．95±0．23）以（P〈0．01,n=6）,而S1P（2．2μmol／L）组IK从（1．43±0．31）nA下降到（1．02±0．28）nA,统计学有显著性差异（P〈0．01,H=6）.而S1P（1．1μmol／L）＋苏拉明（Summin）（200μmol／L）组与对照相比,IK峰值从（1．29±0．26）nA下降（1．26±0．37）nA,统计学无显著性差异（P〉0．05,n=6）．②应用S1P（1．1μmol／L,2．2μmol／L）后与对照组比较,S1P（1．1μmol／L,2．2μmol／L）分别使内向整流钾电流（IK1）峰值从（-8．94±2．01）nA和（-8．81±1．55）nA下降到（18．86±1．59）nA和（-8．55±1．39）nA,统计学无显著性差异（P〉0．05,n=6）.结论：S1P可降低豚鼠心室肌细胞延迟整流钾电流（IK）的幅值,同时S1P对豚鼠心室肌细胞内向整流钾通道（IK1）没有作用。     

高压氧对肾脏缺血再灌注损伤的保护作用及其机制研究

目的:观察高压氧(hyperbaric oxygen,HBO)对肾脏缺血再灌注损伤的保护作用并探讨其作用机制.方法:56只SD大鼠被随机分为三组,假手术组(n=8);I/R组(n=24),夹闭双肾动脉45分钟后恢复血流灌注;I/R+HBO组(n=24),夹闭双肾动脉45分钟并在恢复血流后1h、24 h、48 h行HBO治疗,每次HBO后采血并取双肾,比色法测定血浆尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)值,原位末端标记(TUNEL)法检测肾小管上皮细胞凋亡情况,实时定量PCR法检测促凋亡基因Bax的mRNA含量.结果:与sham组(BUN值为9.563± 1.384 mmol/L;Cr值为45.912±2.685 mmo1/L,TUNEL值为2.088％)比较,I/R组大鼠再灌注1小时尿素氮(12.5±1.487 mmol/L)和血肌酐水平(51.388±3.092 mmol/L)升高,但差异无统计学意义,而TUNEL阳性细胞数(9.775％)和Bax的mR-NA(3.219± 0.427)表达水平均显著升高(P＜0.05),再灌注24小时及48小时后尿素氮(28.087± 2.012 mmol/L、41.225± 1.397mmol/L)和血肌酐(241.75± 11.853 mmol/L、278.75± 12.578 mmol/L)水平、TUNEL阳性细胞数(12.512％、14.413％)和Bax的mRNA(5.541±0.227、6.407± 0.291)表达水平均显著升高(P＜0.05);而HBO治疗可显著降低再灌注24小时及48小时的大鼠尿素氮(14.15±1.397 mmol/L、25.962± 2.497 mmol/L)和血肌酐(146.375± 8.782 mmolL、210.125± 11.519 mmol/L)水平(P＜0.05),但仍显著高于假手术组(P＜0.05).结论:HBO治疗可以改善I/R后肾功能,其作用机制可能与在早期明显降低Bax的mRNA表达,减轻肾小管上皮细胞凋亡有关.     

三种手术入路显露男性后尿道的比较（英文）

目的：评价经耻骨上、耻骨下及会阴三种手术入路暴露尿道膜部的优劣。方法：对35具成年男性尸体标本解剖,测量并比较耻骨上缘中点（A）、耻骨下缘中点（B）及会阴部两坐骨结节连线中点（c）分男11到尿道球膜部连接处（D）、前列腺尖（E）及膀胱颈（F）的距离及相关角度;对另20具成年男性尸体标本分别经3种手术入路显露后尿道,标记可能损伤的组织器官并评分。结果：AD=（6．5±0．5）cm,BD=（2．2±0．5）cm,CD=（3．4±0．6）cm,其中BD〈CD〈AD（P〈0．05,SNK法）;AE=（6．6±0．5）cm,BE=（3．0±0．5）cm,CE=（4．4±0．7）cm,其中BE〈CE〈AE（P〈0．05,SNK法）;AF=（5．7±0．6）cm,BF=（4．5±0．5）cm,CF=（6．5±0．6）cm,其中BF〈AF〈CF（P〈0．05,SNK法）。各点连线所成角度中,ZEAD（仅。）=（9．3±2．0）。∠EBD（α2）=（17．4±3．8）°,ZECD（α3）=（9．2±1．6）°,其中α1与α2有显著性差异（P〈0．05,t=11．1）,α3与α2有显著性差异（P〈0．05,t=-12．1）,α1与α3无显著性差异（P〉O．05,t=-0．13）;∠FAE（β1）=（22．7±2．6）°,∠FBE（β2）=（32．9±6．4）°,∠FCE（β3）=（15．0±3．2）°,其中β2〉β1〉β3（P〈0．05,SNK法）。经耻骨上入路损伤评分为13分,经耻骨下为18分,经会阴为15分。结论：暴露从优到劣依次为经耻骨下、经耻骨上、经会阴;损伤从大到小依次为经耻骨下、经会阴、经耻骨上部分。     

老年高血压合并2型糖尿病患者血清同型半胱氨酸、血尿酸水平变化及临床意义

目的：探讨老年高血压合并2型糖尿病患者血清同型半胱氨酸（Homocysteine,Hcy）、血尿酸（Serum uric acid,SUA）水平变化及其临床意义。方法：2012年9月至2013年9月期间,我院诊治的40例单纯高血压和40例高血压合并2型糖尿病患者,分别作为对照组和研究组,检测两组血清Hcy、SUA水平。结果：两组患者收缩压、舒张压比较无统计学差异（P〉0.05）。研究组空腹血糖、餐后2h血糖、血清Hcy、SUA均显著高于对照组（P〈0.05）。研究组中血管并发症患者血清Hcy、SUA为（25.0±5.0）μmol/L和（390.0±65.0）mmol/L显著高于无血管并发症患者（17.0±4.0）μmol/L和（330.0±55.0）mmol/L,血管并发症患者FBG、餐后2h血糖与无血管并发症患者比较无统计学差异（P〉0.05）。结论：高血压合并2型糖尿病患者血清Hcy、SUA异常升高,且存在慢性血管并发症患者两者水平更高,血清Hcy、SUA是老年高血压合并2型糖尿病的危险因素。     

血清降钙素原在感染性休克患者中的表达及与APACHEⅡ评分的相关性分析

目的:探讨血清降钙素原在感染性休克患者中的表达及与APACHEⅡ评分的相关性分析。方法:选取2012年1月至2013年9月我院收治的58例感染性休克患者,设为感染性休克组,早期采取液体复苏的方法进行救治。另选取同期于我院体检的年龄、性别与之相匹配的52例健康人设为对照组。测定两组不同时间的血清PCT含量,对APACHEⅡ评分进行评定,并进行统计学分析。结果:感染行休克组患者的复苏液体量最少为4332mL,最多为10645mL,平均为(7602.85±1628.47)mL,复苏达标的平均时间为(17.67±3.75)h。感染性休克组患者血清PCT含量治疗后24h为(8.77±4.66)μg/L,明显低于治疗前的(17.78±5.89)μg/L;感染性休克组患者治疗前与治疗后24h血清PCT含量相比于对照组受试者的(0.03±0.01)μg/L均显著提高;感染性休克组患者治疗前与治疗后24hAPACHEⅡ评分分别为(16.68±3.27)分、(10.46±3.18)分,相比于对照组的(7.22±1.15)分均显著提高;感染性休克组患者APACHEⅡ评分治疗后24h明显低于治疗前。差异有统计学意义(P0.05)。感染性休克组治疗前后PCT含量与APACHEⅡ评分均呈一定的正相关(P0.05);PCT含量变化与快速复苏的液体量呈一定的负相关(P0.05);而与APACHEⅡ评分不存在明显的相关性(P0.05)。结论:将血清降钙素原应用于感染性休克患者的诊断及治疗过程中评估病情变化,能够为液体复苏提供有效的指导。血清降钙素原含量与APACHEⅡ评分呈正相关,但其变化与APACHEⅡ评分不存在相关性,而与复苏液体量呈负相关。