siRNA表达载体的构建及其表达

本研究用限制性内切酶消化质粒pCMV-tag-2B,除去巨细胞病毒(Cytomegalovirus,CMV)启动子核苷酸序列,剩下的核苷酸序列作为构建表达siRNA(Smallinterfering RNA,siRNA)载体的前体.依据文献提供的扩增H1 RNA启动子核苷酸序列的引物序列合成一对引物,以带有H1 RNA启动子序列的质粒DNA为模板扩增H1RNA启动子序列,插入前体,构建SiRNA的表达载体pCH1.另外将H1 RNA启动子插入pGEM-11fz相应位点,构建瞬时表达载体pGH1.依据EGFP的有效SiRNA抑制位点,合成两条分别为64bp的核苷酸链,通过体外退火,形成双链,然后插入已构建的两个表达载体.将这两个载体分别与表达EGFP蛋白的质粒pEGFP-N3共转染Bel-7402细胞,观察siRNA对EGFP的抑制效应.研究结果表明构建的载体有效表达了siRNA,这些载体可以用于与siRNA相关抗病毒治疗性试验研究.     

粗心的表达

发现：细菌将DNA信息转换成蛋白的过程并不是很完美的。以色列希伯来大学的Sigal Ben-Yehuda以及他的的研究小组发现在细菌中转录和翻译产生的错误比之前想象的要多。Ben-Yehuda表示有两种可能,要么细菌没有这种纠错机制,要么就是有意而为,越多的错误就会产生越复杂的蛋白多样性,也就意味这给予细菌适应不利环境的更多机会。     

Stathmin SiRNA表达载体抑制stathmin的表达

目的:构建stathmin特异性SiRNA质粒表达载体,探讨其对鼻咽癌5-8F细胞stathmin的沉默作用.方法:合成用于stathmin基因特异性干扰表达的DNA片段,经退火形成双链DNA片段,片段克隆到质粒表达载体pGenesil 1.1上.载体导入JM109菌株进行筛选与扩增,采用酶切和测序对克隆表达载体进行鉴定.应用脂质体将鉴定后的重组表达质粒载体转入鼻咽癌5 -8F细胞,RT-PCR与Western Blot分析stathmin基因表达.结果:经酶切和测序鉴定,插入SiRNA质粒表达载体的stathmin特异性碱基序列和方向正确.重组质粒表达载体转染鼻咽癌细胞后,细胞转染效率达78.8 ±6.8％,stathmin基因在鼻咽癌中的表达明显下降.结论:构建的stathmin基因SiRNA质粒表达载体能抑制stathmin的表达.     

PDX-1表达质粒的构建及表达

目的:为进一步研究PDX-1基因的功能打下基础.方法:从人的胰腺cDNA中PCR扩增PDX-1基因的阅读框架,构建质粒pAAV-PDX-1.用pAAV-PDX-1转染293T细胞48小时后,用RT-PCR和Western Blot方法检测293T细胞中mRNA和蛋白水平PDX-1的表达.结果:转染了pAAV-PDX-1的293T细胞中有PDX-1的表达,而在转染质粒pAAV-MCS和未转染的293T细胞中均没有检测到PDX-1的表达.结论:构建的pAAV-PDX-1质粒在mRNA和蛋白水平都能表达PDX-1.     

siRNA表达载体的构建及其表达

本研究用限制性内切酶消化质粒pCMV-tag-2B,除去巨细胞病毒(Cytomegalovirus,CMV)启动子核苷酸序列,剩下的核苷酸序列作为构建表达siRNA(Small interfering RNA,siRNA)载体的前体。依据文献提供的扩增H1RNA启动子核苷酸序列的引物序列合成一对引物,以带有H1RNA启动子序列的质粒DNA为模板扩增HIRNA启动子序列,插入前体,构建SiRNA的表达载体pCH1。另外将H1RNA启动子插入pGEM．1lfz相应位点,构建瞬时表达载体pGHl。依据EGFP的有效SiRNA抑制位点,合成两条分别为64bp的核苷酸链,通过体外退火,形成双链,然后插入已构建的两个表达载体。将这两个载体分别与表达EGFP蛋白的质粒pEGFP．N3共转染Bel．7402细胞,观察siRNA对EGFP的抑制效应。研究结果表明构建的载体有效表达了siRNA,这些载体可以用于与siRNA相关抗病毒治疗性试验研究。     

利用重组噬菌体诱导表达的大肠杆菌表达系统

将编码噬菌体T7RNA聚合酶的基因克隆至噬菌体M13mpl8RFDNA中,置于lac启动子的控制之下,得到了可表达T7 RNA聚合酶的重组噬菌体M13HEP。利用该噬菌体感染含T7启动子表达质粒的宿主菌以提供T7RNA聚合酶,可以诱导T7启动子控制下的外源基因的表达。该噬茵体诱导表达系统已成功地表达了多种外源基因,特别是一些表达产物对宿主菌有毒性的基因。同时,通过细菌接合将F',因子从大脑杆菌XL1-blue转至大肠杆菌HMS174,构建了新的大脑杆菌菌株HMSl74F,,使得T7表达质粒构建、表达及单链制备可以在同一菌株中完成,得到了一个完整的T7表达系统。     

心脏特异表达基因ASBIO的克隆及表达

从人类心脏文库中成功克隆了一个新的含有锚蛋白重复序列及SOCS盒结构域蛋白（ Ankyrin repeat and SOCS box protein, ASB）的家族成员ASBIO。该基因定位于染色体7q36．1,开放阅读框包含1329个核苷酸,由7个锚蛋白重复序列和1个SOCS盒组成,编码452个氨基酸,分子量大约是49．5kD。物种间的进化型分析比较表明该基因是非常保守的,人的ASB10基因和小鼠的Asb10基因有84．8％的同源性。半定量RT-PCR实验结果证明Asb10基因在成年小鼠的心脏和肌肉组织中高表达,提示其可能与心脏和肌肉组织的发育有关。亚细胞定位显示ASB10蛋白在细胞质和细胞核均有表达,为进一步研究奠定了基础。     

MAGE-3原核表达载体的构建和表达

通过RT-PCR扩增957bp的MAGE-3全长编码序列,将该片段克隆至Pgex-4T-2原核表达载体,转化大肠杆菌BL-21,经IPTG诱导表达,并经12%SDSPAGE凝胶电泳,考马斯亮蓝染色及Western blot鉴定,证明了目的基因的有效表达,目的蛋白高达细菌总蛋白的32%。表达产物经Glutathione Sepharose 4B 纯化后,每100mL菌液最终可获得3mg的目的蛋白,蛋白纯度在90%以上。纯化的GST-MAGE-3蛋白在体外冲击树突状细胞,能诱导特异性CTL杀伤肿瘤细胞活性。     

核酸疫苗双表达载体的构建及表达

将微小病毒内部核糖体进入位点(IRES)基因克隆到质粒pVAXI载体多克隆位点,构建出核酸疫苗双表达载体pVI。将绿色荧光蛋白(EGFP)基因和新霉素磷酸转移酶(neor)基因作为报告基因,连接到pVI载体IRES基因的前后两处多克隆位点,构建出表达载体pEIN。通过脂质体介导的方法将该载体转染COS-7细胞,筛选到同时表达绿色荧光蛋白和新霉素磷酸转移酶的表达株,表明成功地构建了核酸疫苗双表达载体,为构建多价核酸疫苗及带有分子佐剂的核酸疫苗打下了基础。     

NOD1真核表达质粒的构建及表达

目的:构建天然免疫胞内识别受体核苷酸寡聚域1(NOD1)真核表达质粒。方法:NOD1基因片段经PCR扩增获得,经酶切后连接到真核表达载体pcDNA3/flag中,对挑选出的阳性克隆测序,将序列正确的重组质粒pflag-NOD1转染293T细胞,用Western印迹检测目的蛋白的表达,同时用NF-κB的萤光素酶报告基因检测NOD1蛋白的活性。结果:pflag-NOD1可以在真核细胞293T中表达,并可以增强NF-κB报告基因的转录活性。结论:构建了重组质粒pflag-NOD1,在细胞中表达NOD1后能够提高NF-κB转录的生物活性,为进一步研究NOD1的功能奠定了基础。     

小麦花粉特异性表达的cDNA的分离及表达特性

应用抑制差示杂交和5′/3′RACE PCR方法分离了小麦(Triticum aestivum L.)花粉特异性表达的全长cDNA(TaPSG719,GenBank:AY451238)),该基因全长1 172 bp,5′非编码区序列长达329 bp,包含多个上游可译框架(uORF);该基因编码1 88个氨基酸的蛋白质,大小约20 kD,等电点为12.1.Northern杂交和RT-PCR分析表明该基因在成熟花粉特异表达,而在小孢子、叶片、根和未成熟的种子、幼茎和子房等组织几乎检测不到.进一步研究小麦花粉发育过程的表达水平表明,TaPSG719在单核和双核小孢子阶段不表达,在开花前5 d(已完成有丝分裂)开始表达并迅速增强达到高峰,但随着花粉的成熟表达水平逐渐下降.表明TaPSG719是一个花粉中晚期特异性表达基因.经BLAST同源性分析表明,与目前已登录的基因没有显著的同源性.Southern杂交表明TaPSG719可能为一个多拷贝基因.为研究TaPSG719 cDNA 5′非编码区序列的uORF对可译框架的翻译的影响,构建不同缺失或突变的表达载体,采用麦胚体外翻译系统,结果显示含uORF的5′非编码区序列能显著抑制蛋白质的翻译水平,表明TaPSG719基因表达至少部分是在翻译水平上调控.     

猪抵抗素(resistin)表达载体的构建、表达及表达产物的纯化鉴定

用PCR方法扩增到抵抗素基因(RSTN)并将其亚克隆至pET-32a(+)表达载体,获得重组质粒pET-RSTN.将重组质粒转化大肠杆菌BL-21(DE3)感受态细胞,用IPTG诱导表达.SDS-PAGE检测结果表明,重组resistin蛋白分子量大小约30kDa.对表达条件如温度、IPTG浓度及诱导时间进行优化并用SDS-PAGE检测.结果表明,30℃、4h、IPTG浓度为1mmol/L时,可溶性重组resistin的含量最高.表达产物经Western blot检测证实是Resistin蛋白,并用镍离子亲和层析的方法获得纯化的Resistin蛋白.     

三种乳腺特异表达载体表达特性的比较

为了比较不同来源乳腺特异表达载体的表达特性 ,将人溶菌酶 (hLYZ)cDNA分别克隆入自行构建的p2 0 5C3载体和国外引进的pBJ41和pBC1载体。重组载体p2 0 5C3LYZ、pBJLYZ和pBCLYZ分别用 2 5kDaPEI包裹后 ,通过尾静脉途径注射哺乳期小鼠。注射后 72h采集乳样 ,经微球菌溶解实验证明 ,3组小鼠乳汁中hLYZ的表达量分别为 87、69、60mg L ;从每组小鼠的 1 2种组织提取总RNA ,经Dotblotting检测证明 ,三种重组载体除在乳腺中表达外 ,p2 0 5C3LYZ还在小鼠的脾和肠、pBJLYZ在脾、pBCLYZ在脾和肾中具有一定的异位表达 ;在有hLYZmRNA转录的上述脏器中用微球菌溶解试验均可检测到hLYZ活性。这些实验结果表明 ,自行构建的乳腺特异表达载体的表达特性与从国外引进的表达载体无明显差别。     

新型生长抑素原核表达质粒的构建及表达鉴定

将生长抑素(SS)与乙肝表面抗原(S)融合基因插入平衡致死系统原核表达质粒pYA3493中, 转化至缺失asd基因的减毒猪霍乱沙门氏菌C500, 经酶切、测序筛选得到非抗性的目的克隆, 命名为pYA-SS。应用SDS-PAGE和Western blotting 技术分离并检测融合蛋白在宿主菌中的表达活性。结果表明, 本试验构建的非抗性筛选生长抑素原核表达质粒可以在宿主菌C500中稳定、正确表达。此研究为开发新型、高效、安全的促生长疫苗提供了可靠的研究材料。     

Tropic1808基因的原核表达及其表达产物的生物活性

Tropic180 8基因是新近获得的一个鼠源性的cDNA .Tropic180 8基因开放阅读框架片段通过PCR方法从质粒中扩增后 ,重组入表达载体pET 2 1a中 ,转化大肠杆菌BL2 1(DE3 ) .用IPTG诱导目的蛋白的表达 ,SDS PAGE并凝胶图象分析确定目的蛋白表达水平占细菌总蛋白的 14%以上 .表达蛋白在N端融合有 16个氨基酸 ,将表达蛋白电转移至PVDF膜 .氨基酸序列分析表明 ,其N端第 17～ 2 5位氨基酸序列与Tropic180 8基因编码序列一致 .利用融合部分含T7·Tag ,通过亲和层析纯化表达蛋白 ,经Westernblot检测为目的蛋白 ,加入到无血清培养的新生SD大鼠背根神经节 (DRG)中 ,观察到表达蛋白对DRG具有促进存活和促进突起生长的作用 .     

小鼠pEGFP-Hoxa11真核表达载体的构建及表达

目的 构建和鉴定Hoxa11和EGFP双基因共表达真核载体.方法 采用DNA重组技术,将目的 基因Hoxa11克隆至含有报告基因EGFP的pEGFP-N1真核表达载体中,构建的真核表达载体pEGFP-Hoxa11经PCR,双酶切及基因测序鉴定;转染至CHO细胞,荧光显微镜下观察重组质粒的表达,提取细胞蛋白Western印迹检测蛋白表达.结果 pEGFP-Hoxa11重组质粒构建成功.构建的真核表达载体pEGFP-Hoxa11能在CHO细胞中有效表达.结论 成功构建了共表达Hoxa11和EGFP的真核表达载体,并能在CHO细胞中有效表达.为进一步研究Hoxa11的功能提供实验基础.     

鸡输卵管特异表达载体的构建及其体内表达

用高保真PCR法分别从中国狼山鸡基因组DNA中扩增出卵清蛋白基因(ov)的5′和3′调控区,将其克隆入pGEMT载体,经序列测定证明与已发表的ov基因相应区域无差异。将上述调控序列插入黏粒载体,构建成鸡输卵管特异表达载体pOV。再将lacZ报告基因克隆在上述载体5′调控区的下游,获得的重组载体命名为pOVlacZ。用脂质体包裹的pOVlacZ注射产蛋鸡,RTPCR检测结果表明lacZ基因仅在注射鸡输卵管的膨大部表达,不能在肝、脾、肾、心等组织表达。在上述组织中,仅输卵管膨大部能检测出β半乳糖苷酶活性(1167mUml),注射雌激素对报告基因的表达具有促进作用(1533mUml),重组酶能被分泌到鸡蛋的蛋清中(1733mUml)。结果表明,克隆的鸡ov基因调控区能有效驱动报告基因在输卵管的特异表达,构建的载体能用于鸡输卵管生物反应器的研制。     

小麦花粉特异性表达的cDNA的分离及表达特性

应用抑制差示杂交和5′/3′RACE PCR方法分离了小麦(Triticum aestivum L.)花粉特异性表达的全长cDNA(TaPSG719,GenBank:AY451238)),该基因全长1172 bp,5′非编码区序列长达329 bp,包含多个上游可译框架(uORF);该基因编码188个氨基酸的蛋白质,大小约20 kD,等电点为12.1。Northern杂交和RT-PCR分析表明该基因在成熟花粉特异表达,而在小孢子、叶片、根和未成熟的种子、幼茎和子房等组织几乎检测不到。进一步研究小麦花粉发育过程的表达水平表明,TaPSG719在单核和双核小孢子阶段不表达,在开花前5d(已完成有丝分裂)开始表达并迅速增强达到高峰,但随着花粉的成熟表达水平逐渐下降。表明TaPSG719是一个花粉中晚期特异性表达基因。经BLAST同源性分析表明,与目前已登录的基因没有显著的同源性。Southern杂交表明TaPSG719可能为一个多拷贝基因。为研究TaPSG719 cDNA 5′非编码区序列的uORF对可译框架的翻译的影响,构建不同缺失或突变的表达载体,采用麦胚体外翻译系统,结果显示含uORF的5′非编码区序列能显著抑制蛋白质的翻译水平,表明TaPSG719基因表达至少部分是在翻译水平上调控。     

单链抗体的表达

单链抗体(scFv)是具有抗体活性的最小功能结构单位,是基因工程抗体研究领域中的热点,具有比单克隆抗体在生物病原体、微生物污染和寄生虫病等预防、检测和治疗的独特优点和应用前景.鉴于其重要性,单键抗体在不同的表达系统中得到表达与研究.简要综速了scFv的表达.     

鸡输卵管特异表达载体的优化及体内表达

为了实现鸡输卵管特异表达载体在相应组织特异高产表达, 并简化质粒DNA的制备过程, 本研究在已经构建的鸡输卵管特异表达载体pOV1基础上进行了优化改造, 为进一步进行重组药物蛋白的暂态表达及转基因鸡研究奠定基础。首先用限制性内切酶将克隆在pOV1载体的鸡卵清蛋白基因5￠-和3￠-调控区切出, 同时克隆到切除neo基因及CMV启动子的pcDNA3.0载体, 构建成另一输卵管特异表达载体pOV2; 将鸡卵清蛋白基因5￠-调控区单独克隆入同样载体, 获得第三个鸡输卵管特异表达载体pOV3。为了检验三个输卵管表达载体驱动外源基因在鸡体内输卵管细胞中表达的有效性和特异性, 将LacZ报告基因分别克隆入pOV1、pOV2、pOV3中5'-调控区的下游, 获得的重组载体pOV1LacZ、pOV2LacZ和pOV3LacZ经聚乙烯亚胺包裹后, 经翅静脉注射产蛋鸡。用RT-PCR和酶活性检测法对LacZ基因在载体注射鸡体内的表达进行检测, 结果显示肝、脾、肾、心等组织中无LacZ基因的表达, 而输卵管膨大部不仅有LacZ基因的表达, 而且表达的重组酶能分泌到蛋清中, 雌激素注射对报告基因的表达具有促进作用, 其中pOV3LacZ的表达水平较高。这些试验结果表明, 鸡输卵管特异表达载体pOV3具有结构相对简单、表达水平较高、组织特异性较好等优点, 能用于鸡输卵管生物反应器的研制。