布鲁氏菌BP26基因标记疫苗株的构建及鉴别PCR方法的建立

[目的]由于现有的减毒活疫苗仍存在较强的毒力,因抗原与毒株的差异不大而很难区分疫苗免疫和自然感染等缺点,限制了现有布鲁氏菌减毒活疫苗的广泛应用.本文拟对布鲁氏菌的减毒活疫苗株M5进行遗传改造,克服这些缺点.[方法]本研究利用同源重组的方法,用卡那抗性基因替换了布鲁氏菌减毒疫苗株M5的BP26基因,得到了新的标记疫苗株M5△BP26.分别用标记疫苗株和野生株侵染巨噬细胞和感染小鼠,比较分析标记株在细胞内和小鼠体内的存活能力.根据种特异性保守基因dnaK和缺失的BP26基因设计引物,建立双重PCR,用于区分标记株与野生株.[结果]成功构建了.BP26基因标记疫苗株,细胞实验和动物实验结果表明,标记株仍能在胞内和小鼠内存活,具备作为减毒活疫苗的特性.小鼠实验结果显示,感染后两周野生株的细菌数为1022.9 ,而突变株为101.1 (P<0.01),至第3周野生株的细菌数为102.2 ,而突变株未能检出,表明与原疫苗株相比,标记株的感染力进一步减弱.根据DNA序列的差异,建立了能够区分标记疫苗株与野生株的双重PCR方法,标记株因只能扩增出一条带而能与野生株和毒株相区分,从而可以区分自然感染和疫苗免疫.[结论]基因标记疫苗株的构建及鉴别PCR方法的建立,为布鲁氏菌疫苗的进一步研发奠定了基础.     

NOD1真核表达质粒的构建及表达

目的:构建天然免疫胞内识别受体核苷酸寡聚域1(NOD1)真核表达质粒。方法:NOD1基因片段经PCR扩增获得,经酶切后连接到真核表达载体pcDNA3/flag中,对挑选出的阳性克隆测序,将序列正确的重组质粒pflag-NOD1转染293T细胞,用Western印迹检测目的蛋白的表达,同时用NF-κB的萤光素酶报告基因检测NOD1蛋白的活性。结果:pflag-NOD1可以在真核细胞293T中表达,并可以增强NF-κB报告基因的转录活性。结论:构建了重组质粒pflag-NOD1,在细胞中表达NOD1后能够提高NF-κB转录的生物活性,为进一步研究NOD1的功能奠定了基础。     

布鲁氏菌vjbR突变株的构建及其毒力表型分析

为分析vjbR在布鲁氏菌毒力中的作用,构建了vjbR的突变株和互补株,并分析了它们在巨噬细胞和小鼠体内的存活能力。利用同源重组的方法,用卡那抗性基因替换了16M的vjbR(BMEII1116)基因,得到了vjbR的缺失突变株16M△vjbR。将vjbR基因的ORF克隆到pMD18-T载体中,然后将其转入到突变株16M△vjbR中得到互补株16M△vjbR-C。用16M、16M△vjbR和16M△vjbR-C侵染巨噬细胞和感染小鼠,比较分析它们在巨噬细胞内的生存能力及小鼠毒力。研究结果表明vjbR突变株在巨噬细胞和小鼠体内的毒力减弱,存活能力下降,说明vjbR基因是布鲁氏菌16M的毒力相关基因,对于布鲁氏菌建立慢性感染是必要的。     

锦灯笼宿萼提取物体外抗菌作用研究

采用纸片扩散法对锦灯笼宿萼提取物进行体外抗菌试验研究,以了解其抗菌谱。结果表明该提取物对金黄色葡萄球菌、甲型链球菌、乙型链球菌、蜡样芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌均有抑制作用,而对绿脓杆菌、大肠杆菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌以及白色念珠菌均无抑制作用,表明锦灯笼宿萼提取物中存在有效抗菌成分,其中以甲链、乙链、金葡菌高度敏感,锦灯笼宿萼精制提取物最低抑制浓度为25~50 g/L。     

贡菜提取液的抗病原性真菌活性研究

用1：1的丙酮水对贡菜干品浸提,经减压回收丙酮,以乙酸乙酯萃取,再减压回收乙酸乙酯,得到贡菜提取液。以人体致病性和条件致病性真菌为指标菌,采用试管法对贡菜提取液进行体外抑制和杀灭试验,以了解贡菜提取液的抗真菌活性。试验结果表明,贡菜提取液对白色念珠菌、烟曲霉菌、新生隐球菌、石膏状小孢子菌、短帚霉菌和狗小孢子菌等均有不同程度的抑制和杀灭作用。表明贡菜提取液中存在有抗真菌有效成分,对病原性真菌有不同程度的抑制和杀灭活性。