根癌农杆菌介导AtNHX1基因转化番茄的研究

构建AtNHX1基因植物表达载体,通过农杆菌介导法将其转入番茄。探讨了外植体类型、农杆菌菌株和不同筛选标记对芽诱导分化的影响。对抗性植株进行PCR检测,获得15株转基因植株。对转基因番茄T1代进行80mmol/LNaHCO胁迫处理,转基因植株的相对生长量高于对照植株,显示AtNHX1基因的导入提高了番茄对碱性盐的耐受性。     

hBMP-3m基因在烟草中的表达

PCR扩增人骨形成蛋白-3成熟肽(hBMP-3m)cDNA,纯化后连接人pUC19质粒,构建克隆载体pUC19B3m;用EcoR Ⅰ和HindⅢ酶解pUC19B3m和pJIT163,将目的片段插入pJIT163,构建中间载体pJIT163-B3m;再构建植物表达载体pCAMBIA1300-B3m。利用冻融法将质粒pCAMBIA-hBMP3m转入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404。以烟草(Nicotiana tabacum L.)无菌苗叶盘为外植体,通过根癌农杆菌介导法进行遗传转化,获得了在含25mg／L潮霉素(Hygromycin,Hyg)的筛选培养基上再生的抗性植株,经PCR证实其中部分植株已将人骨形成蛋白-3成熟肽基因整合到烟草基因组中,Western Blot结果表明已有微量BMP表达。关键词：人骨形成蛋白-3成熟肽(hBMP-3m);烟草;根癌农杆菌介导法。     

根癌农杆菌介导的乙肝表面抗原基因对烟草的转化

构建了植物表达载体pBRSAg,该载体具有完整的植物表达元件,CaMV35S启动子、农杆菌T-DNA左右边界、植物报告基因gus和植物选择标记基因hpt,适用于农杆菌的转化;通过冻融法将重组质粒pBRSAg转入根癌农杆菌LBA4404中,利用农杆菌介导法转化烟草叶盘,经筛选培养获得烟草植株。抗性植株经GUS染色和PCR检测为阳性,初步表明乙肝表面抗原基因在烟草中得到表达。     

表达β-1,3-葡聚糖酶及几丁质酶基因的转基因烟草及其抗真菌病的研究

利用烟草碱性β－１,３－葡聚糖酶及菜豆碱性几丁质酶基因构建了组成型表达的双价植物表达载体ｐＢＬＧＣ,利用农杆菌介导法转化了烟草,并得到了转基因植株。对其进行分子生物学分析的结果表明,部分转基因植株在所有检测中都显示较强的阳性反应,这说明外源基因已整合到烟草基因组中得到正确表达。活体接菌实验初步表明,转基因植株与对照相比,对赤星病的侵染具有较强的抵抗能力。     

通过根瘤农杆菌介导法获得菊花转基因植株

以带叶茎段为外植体,通过根癌农杆菌介导法,将兔防御素NP－1基因导入菊花品种“001”中。经梯度卡那霉素（kanamycin,Km）筛选,获得了大量Km抗性植株,其中部分Km抗性植株经Southem杂交鉴定为转基因植株。从而成功地建立了菊花遗传转化系统,为菊花分子育种奠定了基础。     

根癌农杆菌介导麝香百合遗传转化体系的建立

以麝香百合"white elegance"叶片为外植体,通过根癌农杆菌介导法,研究了影响其转化的因素,建立了稳定而高效的麝香百合遗传转化体系。结果表明,以叶片为受体材料,外植体预培养有利于农杆菌的侵染;3 d的共培养,根癌农杆菌OD600值为0.6左右、侵染10 min,能获得较高的转化率;50 mg.L-1的卡那霉素对叶片有很好的筛选效果。抗性植株经PCR检测,初步证明Mn-SOD基因已转入到麝香百合植株中。     

转HSl^prol基因番茄植株的获得

目的：为了减少根结线虫对番茄的危害,研究并获得转抗线虫基因HSl^prol。番茄植株。方法：在鉴定表达载体之后,采用CaCl2法制作农杆菌EHAl05感受态细胞,然后用冻融法将HSl^prol基因转入农杆菌中。通过农杆菌介导法将HSl^prol基因导入无菌番茄外植体中,获得抗根结线虫转化再生植株。用卡那霉素筛选到再生植株后,提取抗性芽的基因组,利用设计好的引物进行PCR鉴定。结果与结论：目的基因已整合到番茄基因组中,获得了转HSl^prol基因番茄植株。     

转HS1prol基因番茄植株的获得

目的为了减少根结线虫对番茄的危害,研究并获得转抗线虫基因HS1prol番茄植株.方法在鉴定表达载体之后,采用CaCl2法制作农杆菌EHA105感受态细胞,然后用冻融法将HS1prol基因转入农杆菌中.通过农杆菌介导法将HS1prol基因导入无菌番茄外植体中,获得抗根结线虫转化再生植株.用卡那霉素筛选到再生植株后,提取抗性芽的基因组,利用设计好的引物进行PCR鉴定.结果与结论目的基因已整合到番茄基因组中,获得了转HS1prol基因番茄植株.     

转WMV—2CP基因黄瓜植株的再生

以黄瓜无菌苗子叶切段为外植体,通过叶盘转移化法与根瘤农杆菌进行共培养建立了黄瓜的转其因系统。农杆菌菌株为ＬＢＡ４４０４,内含双元载体ｐＢＰＭＷＭＶ。该质粒载体带有一个ｎｐｔ－Ⅱ基因（筛选具有卡那霉素抗性的植株）和一个ＷＭＶ－２ＣＰ基因。抗卡那霉素（Ｋａｎ＾ｒ）的黄瓜植株经ＤＮＡ分子点杂交、ＰＣＲ检测以及Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ证实,外源的ＷＭＶ－２ＣＰ基因确实已导人瓜细胞且能稳定地遗传到子一代。     

转反义磷脂酶Dγ基因白三叶草的获得

利用根癌农杆菌介导法将反义磷脂酶Dγ基因 (PLDγ)转入白三叶草。建立了白三叶草的继代及高频再生系统 ,对传统农杆菌侵染方法进行了改良 ,通过抗生素筛选获得大量抗性植株。对抗性植株进行了PCR和PCR Southern杂交鉴定 ,证实PLDγ基因已整合入白三叶草核基因组中。     

Construction of genetically modified tobacco (<Emphasis Type="Italic">Nicotiana tabacum</Emphasis> cv. Petit Havana) harboring <Emphasis Type="Italic">ompH(A:3)</Emphasis> from <Emphasis Type="Italic">Pasteurella multocida</Emphasis> (A:3)

Fowl cholera, caused by Pasteurella multocida (A:3), is a fearsome disease leading to a nonproductive influence upon poultry industry. It has been known that outer membrane protein H (OmpH) in the bacterium is a strong candidate to bring on the notorious ailment. Genetically modified (GM) tobacco (Nicotiana tabacum cv. Petit Havana) harboring ompH(A:3) was constructed to develop a plant expression system for the protein, OmpH(A:3). Some 987 bp-long (ORF with the stop codon, TAA) of the ompH(A:3) excluding the nucleotide for signal peptide, was amplified by RT-PCR with the gene specific primers and pGEM-T-ompH(A:3) as template DNA. The PCR-amplified DNA was ligated into BamHI/Sacl-cut pBI121 to obtain a recombinant plasmid, pBI121-ompH(A:3). It was then transformed into Agrobacterium tumefaciens (LBA 4404) by liquid nitrogen method to generate a recombinant clone of Agrobacterium LBA4404/pBI121-ompH(A:3). The Agrobacterium LBA4404/pBI121-ompH(A:3) was inoculated into leaf discs of tobacco (2 day old). The gene-transfected leaves were cultured on Murashige-Skoog basal medium containing kanamycin (50 mg/mL) to generate numerous calli, from which some GM tobacco plants were obtained. Transgenicity of the tobacco plant was confirmed by PCR screening along with the DNA sequencing. Also, its expression in the GM-tobacco was examined qualitatively as well as quantitatively by ELISA/Western blot. These results suggest that the genetically modified tobacco plant can be potentially used as a model system to develop plant-based vaccine against the fowl cholera.     

美洲商陆抗真菌蛋白转化烟草的研究和抗病性检测

本研究为美洲商陆抗病毒蛋白(PaAFP)基因首次对植物遗传转化的研究,转入烟草中研究此蛋白对烟草立枯病的抗性。从美洲商陆叶片中获得美洲商陆抗真菌蛋白前体蛋白基因cDNA序列,构建植物表达载体pCAMBIA1300-PaAFP,通过三亲杂交法将其导入根癌农杆菌LBA4404受体菌,转染烟草获得了大量再生转基因植株。PCR、Southern杂交、RT-PCR以及Tris-Tricine-SDS-PAGE检测结果表明目的基因已经整合到烟草基因组中,并且已经得到转译。转基因植株苗期抗立枯病试验表明,转基因烟草植株对立枯丝核菌表现出了抗性。     

高效烟草遗传转化体系的建立及甜蛋白基因的导入

以烟草无菌茁叶片为外植体,通过根癌农杆菌LBA4404介导法,将Thamnatin基因导人烟草中,经梯度卡那霉素(Kana-mycin,Km)筛选,获得可在含75mg／L、100mg／L Km选择生根培养基上再生的抗性植株,其中部分Km抗性植株经PCR检测为阳性,转化率为31．3％,初步鉴定已成功地建立了烟草遗传转化系统,为进一步探讨甜蛋白在植物中的转化和表达情况奠定基础。     

大豆fad基因反义表达载体构建及转化烟草研究

使用PCR方法从大豆基因组DNA中扩增出大豆油酸脱饱和酶基因fad2-1,连接到pMD18-T载体中,转化大肠杆菌JM109菌株.测序后,用DNAstar软件进行同源性比对.然后将正确的序列反向克隆到表达载体pBt,并转化农杆菌菌株LBA4404,经双酶切鉴定和PCR扩增检测,获得具有该基因反向序列的农杆菌工程菌,转化...     

人干扰素α-2b基因在烟草中的表达研究

应用PCR的技术从质粒pAIFN中扩增人干扰素α-2b(Human interferon α-2b,HuIFN α-2b)编码基因,将其连接到pBI121双元载体构建植物真核表达载体pBIFN;用冻融法将该载体转染根癌农杆菌LBA4404;并用叶盘浸染法转化烟草叶片,经转化的烟草叶片的组织培养,诱导愈伤获得再生植株。通过应用PCR,RT-PCR,Wes-tern blot和WISH/VSV方法检测获得的烟草再生植株,结果表明HuIFN α-2b基因已成功整合进烟草核基因组并表达出具有活性的HuIFN α-2b蛋白。本文对HuIFN α-2b基因在烟草核系统中的表达进行了研究,为进一步在烟草叶绿体系统中该基因的表达研究奠定了基础。     

二次转化获得整合phbA、phbB、phbC基因的转基因烟草(英文)

将携有导肽序列的phbB(编码乙酰乙酰CoA还原酶 )和phbC(编码PHB合酶 )连入pBIB_HYG得到组成型表达载体pZCB ,用冻融法转入根癌土壤杆菌 (Agrobacteriumtumefaciens (SmithetTownsend)Conn)并由其介导转化已整合且表达phbA(编码 3_酮硫裂解酶 )基因并具有卡那霉素抗性的转基因烟草 (NicotianatabacumL .)。通过二次转化可避开传统杂交育种 ,在 5个月内获得整合PHB合成所需 3个基因的转基因烟草。所获转基因植株表型正常 ,经PCR、PCR_Southern、RT_PCR_DNA杂交检测确定有 5 0株烟草稳定整合phbB、phbC基因 ,其中 6 .6 7%的植株可在转录水平表达双基因     

基于TAC载体的水稻转化系统的建立

将含有大约50kb水稻基因组片段的TAC17克隆(NK15)通过电击转化到农杆菌LBA4404中,经多次继代培养,该克隆在农杆菌中是稳定的。用常规的农杆菌介导方法将该克隆转化粳稻品种农垦58S成熟胚的愈伤组织,对T0代进行PCR和Southern杂交分析表明,TAC17所携带的50kb外源DNA片段已完整地整合到水稻基因组上,整合方式多数为单位点插入,整合位点是随机的。经T1代分析表明,外源基因可以稳定地遗传,而且进一步确定外源大片段的整合方式为为单位点插入。     

菠菜甜菜碱醛脱氢酶基因在烟草中的表达

质粒pLS9含有1．5kb的编码菠菜甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因。经限制酶切后克隆到植物表达载体的35S启动子和PolyA终止子之间。经农杆菌介导转化烟草,获得90多株抗卡那霉素再生植株。经PCR检测证明60％以上再生植株含有BADH基因。转基因植株经Western blot,BADH酶活性测定,BADH酶活性特异性染色法检查和耐盐性分析,证明菠菜BADH基因在烟草正常表达。在叶绿体和胞液中均有BADH酶存在。转基因植株能耐较高浓度盐。     

人干扰素α-2b 基因在烟草中的表达研究

应用PCR的技术从质粒pAIFN中扩增人干扰素α-2b（Human interferon α-2b,HuIFN α-2b）编码基因,将其连接到pBI121双元载体构建植物真核表达载体pBIFN;用冻融法将该载体转染根癌农杆菌LBA4404;并用叶盘浸染法转化烟草叶片,经转化的烟草叶片的组织培养,诱导愈伤获得再生植株。通过应用PCR,RT-PCR,Wes-tern blot和WISH/VSV方法检测获得的烟草再生植株,结果表明HuIFN α-2b基因已成功整合进烟草核基因组并表达出具有活性的HuIFN α-2b蛋白。本文对HuIFN α-2b基因在烟草核系统中的表达进行了研究,为进一步在烟草叶绿体系统中该基因的表达研究奠定了基础。