家蚕色氨酸羟化酶(TRH)基因的克隆及表达特性分析（英文）

5-羟色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)是生物界广泛分布的信号分子,涉及动物的重要行为。5-HT是色氨酸羟化酶(Tryptophan hydroxylase, TRH)将L-色氨酸羟化为5-羟-L-色氨酸,5-羟-L-色氨酸随即被多巴脱羧酶(Aromatic L-amino acid decarboxylase, DDC)脱羧而成。TRH作为5-HT合成的限速酶,在无脊椎动物神经调控中具有重要地位。鳞翅目昆虫中TRH的功能研究并不多。在家蚕中克隆了家蚕TRH (Bombyx mori TRH, BmTRH)的cDNA序列1667bp,其中包含1632bp的开放读码框(Openreadingframe,ORF)。人类TPH或者果蝇TRH(Drosophila TRH, DmTRH)与BmTRH有高度相似性,尤其BmTRH和DmTRH之间大多数氨基酸保守说明它们在系统发育上的密切关系并可能有相似功能。基因表达分析显示BmTRH主要表达于头部和中枢神经组织,免疫组织化学和Western blotting结果显示BmTRH只存在于神经组织中,即BmTRH可能仅参与家蚕的神经活动。此外,家蚕DDC(B.moridecarboxylase,BmDDC)和蛋白具有TRH活性的苯丙氨酸羟化酶基因(Phenylalanine hydroxylase, BmPAH)也在中枢神经系统中有表达,暗示家蚕神经系统5-HT的合成与果蝇中不同,可能有两种不同的调控机制。     

家蚕色氨酸羟化酶 (TRH) 基因的克隆及表达特性分析

5-羟色胺 (5-hydroxytryptamine, 5-HT) 是生物界广泛分布的信号分子,涉及动物的重要行为。5-HT是色氨酸羟化酶 (Tryptophan hydroxylase, TRH) 将L-色氨酸羟化为5-羟-L-色氨酸,5-羟-L-色氨酸随即被多巴脱羧酶 (Aromatic L-amino acid decarboxylase, DDC) 脱羧而成。TRH作为5-HT合成的限速酶,在无脊椎动物神经调控中具有重要地位。鳞翅目昆虫中TRH的功能研究并不多。在家蚕中克隆了家蚕TRH (Bombyx mori TRH, BmTRH) 的cDNA序列1 667 bp,其中包含1 632 bp的开放读码框 (Open reading frame, ORF)。人类TPH或者果蝇TRH (Drosophila TRH, DmTRH) 与BmTRH有高度相似性,尤其BmTRH和DmTRH之间大多数氨基酸保守说明它们在系统发育上的密切关系并可能有相似功能。基因表达分析显示BmTRH主要表达于头部和中枢神经组织,免疫组织化学和Western blotting结果显示BmTRH只存在于神经组织中,即BmTRH可能仅参与家蚕的神经活动。此外,家蚕DDC (B. mori decarboxylase, BmDDC) 和蛋白具有TRH活性的苯丙氨酸羟化酶基因 (Phenylalanine hydroxylase, BmPAH) 也在中枢神经系统中有表达,暗示家蚕神经系统5-HT的合成与果蝇中不同,可能有两种不同的调控机制。     

植物转录因子家族在耐盐抗旱调控网络中的作用

植物对干旱和高盐环境的适应是一个复杂的生物学过程,涉及多条信号通路的交叉调控。其中,通过转录因子发挥的调控作用对增强植物的耐盐抗旱特性具有重要意义。结合最近的相关研究,重点综述了植物中的MYB、b ZIP、WRKY、NAC、AP2/ERF等各类转录因子在响应高盐干旱胁迫的信号通路中与ABA信号通路、ROS信号通路、Sn RK2信号通路及H2O2信号通路等存在的交叉整合作用,以期为利用基因工程手段增强植物的耐盐抗旱性提供更有效的改良途径。     

重庆地区人类免疫缺陷病毒携带者的微孢子虫感染情况调查

目前我国关于微孢子虫感染人的研究相对较少,更没有关于重庆地区人类免疫缺陷病毒(HIV)携带者感染微孢子虫的数据统计。对重庆市公共卫生医疗救治中心收治的22例HIV抗体阳性,但尚未接受抗病毒治疗的患者进行研究。将22例患者粪便样本分别提取总DNA,通过聚合酶链反应(PCR)法和DNA测序等技术对微孢子虫在患者中的感染情况进行检测,并对微孢子虫种类进行鉴定。同时对22例患者的免疫细胞亚群进行计数和分析。结果显示,微孢子虫的感染率为36.3%(8/22),主要由脑炎微孢子虫属(Encephalitozoon spp)的海伦脑炎微孢子虫(E. hellem)和肠脑炎微孢子虫(E. intestinalis)引起。22例患者的免疫细胞亚群分析显示,平均淋巴细胞数0.93±0.13×10⁹/L,CD4^＋T细胞数132±22 个/mL,CD8^＋T细胞数495±91 个/mL,CD4/CD8细胞比值0.37±0.1,表明患者免疫功能受到严重抑制。进一步将微孢子虫感染患者与未感染患者的免疫细胞亚群进行比较发现,感染患者淋巴细胞数为0.51±0.1×10⁹/L,未感染患者为1.17±0.17 ×10⁹/L,两者具有显著差异(P<0.05);感染患者CD4^＋T细胞数为71±27 个/mL,未感染患者为167±28 个/mL,两者具有显著差异(P<0.05);感染患者CD8^＋T细胞数为209±35 个/mL,未感染患者为658±123 个/mL,两者具有显著差异(P<0.05),以上表明微孢子虫感染组的免疫功能受损情况更严重。本研究结果提示微孢子虫的机会性感染与患者免疫功能受损情况密切相关,脑炎微孢子虫属在重庆地区有较高的感染率,这为进一步阐明微孢子虫与宿主相互作用关系奠定基础,也为公共卫生健康管理提供重要参考。     

海伦脑炎微孢子虫分泌蛋白EhPTP4对宿主内质网蛋白降解通路的调控作用

【目的】微孢子虫是一类专性细胞内寄生的真核病原微生物,能够感染人类和几乎所有的动物。本课题以海伦脑炎微孢子虫（Encephalitozoon hellem）为研究对象,探讨其极管蛋白4（EhPTP4）作为一个潜在的分泌性毒力因子在宿主细胞内的定位和功能。【方法】制备EhPTP4的鼠源多克隆抗体,利用间接免疫荧光分析和Western blotting确定EhPTP4在感染细胞中的亚细胞定位;基于序列特征,在HEK293细胞中转染野生型和突变体EhPTP4,分析该蛋白的定位及其对病原增殖的作用;利用RNA-seq对转染EhPTP4的HEK293细胞进行转录组测序,分析EhPTP4引起的宿主基因表达和通路的变化;进一步通过RNAi和细胞转染分析差异表达基因的调控作用,利用RT-qPCR和Western blotting验证调控效果。【结果】EhPTP4的N端具有信号肽,C端具有富含组氨酸的结构域（HRD）和核定位信号序列（NLS）。蛋白定位分析显示,在感染和转染细胞中,EhPTP4均被分泌至宿主细胞核内。在HEK293细胞中过表达EhPTP4显著促进了病原的增殖。RNA-seq和蛋白泛素化分...     

家蚕幼虫血细胞密度变化成因及血细胞密度与耐高温性的关系

[目的]血细胞是昆虫血淋巴免疫的主导者.调查家蚕Bombyx mori幼虫血细胞密度变化和成因、血细胞密度与家蚕抗性的关系,是研究家蚕血细胞相关的免疫调控和抗性育种的重要组成.[方法]用细胞计数板统计家蚕品种大造不同龄期(4龄第1-4天、5龄第1-8天和上蔟期)幼虫10 μL血淋巴中的血细胞数目并计算血细胞密度,利用I...     

不同富硒土壤对烤烟生长及硒吸收转运的影响

以烤烟品种‘云烟87’为材料,采用盆栽试验研究安徽池州烟区不同全硒含量土壤(0.30、0.45、1.00、1.75mg·kg-1)对烤烟生长发育以及硒吸收和转运的影响。结果显示:(1)土壤硒含量≤1.00mg·kg-1时能够促进烤烟生长,而土壤硒含量≥1.75mg·kg-1则抑制烤烟的生长。(2)土壤硒含量的增加能够显著提高烤烟根系、茎秆、叶片的硒含量,烟株各部位的硒含量呈现根系叶片茎秆的特点,且根系硒含量是叶片的2~3倍,叶片硒含量则是茎秆的3~4倍。(3)土壤硒含量由0.30mg·kg-1增加至1.75mg·kg-1时,烟株对硒的吸收系数由1.08显著降低至0.36,次级转运系数则由2.84显著升高至4.03,即土壤硒含量增加降低了根系吸收硒的效率,但却增加了硒在叶中的转运和相对累积量。(4)烤烟整株硒的富集量在土壤硒含量为1.00mg·kg-1时达到最大,每株达到72μg。研究表明,在安徽池州烟区的富硒土壤(0.45~1.00 mg·kg-1)上能够生产出富硒(0.15~0.23 mg·kg-1)烟叶,不需要额外添加外源硒,既可以减少生产成本,也能够避免造成水土污染。     

家蚕幼虫咽侧体体积变化分析

【目的】本试验旨在研究不同生长发育时期家蚕幼虫咽侧体及其腺细胞的变化。【方法】选取家蚕4眠蚕中限品种作为实验材料,对其4龄、5龄等时期进行解剖处理,得到咽侧体后进行透析处理与DAPI染色,在荧光显微镜下成荧光像图,结合软件分析工具测量咽侧体横截面积直径与细胞数量来确定家蚕咽侧体及其腺细胞在不同生长时期的变化。【结果】咽侧体体积随幼虫生长发生了明显增长;咽侧体细胞数目随幼虫生长会增加,但比较缓慢。随着幼虫的生长,腺细胞体积会增大,同时咽侧体体积增长与腺细胞核体积增长有极显著相关性。【结论】家蚕咽侧体体积增长主要源于腺细胞体积的增大而稍带腺细胞数目的增加,家蚕幼虫咽侧体体积与生长发育的时间经过密切相关。     

家蚕微孢子虫ADP/ATP转运蛋白的原核表达及间接免疫荧光定位分析

【目的】家蚕微孢子虫Nosema bombycis ADP/ATP转运蛋白可能参与搬运宿主细胞的能量。本研究克隆家蚕微孢子虫ADP/ATP转运蛋白基因,并进行原核表达、抗体制备及间接免疫荧光定位,为控制和防治家蚕微粒子病提供理论基础。【方法】通过同源序列比对鉴定家蚕微孢子虫N. bombycis ADP/ATP转运蛋白序列,采用生物合成的方法将编码3段面向膜内侧肽段的核酸序列拼接合成,在其两端引入BglⅡ和SalⅠ酶切位点,克隆至pUC57载体并测序,再亚克隆至含有二氢叶酸还原酶（dihydrofolate reductase,DHFR）标签的表达载体pQE40中,然后利用BamHⅠ和SalⅠ酶切获得含有DHFR标签的重组序列,并连接至pET30a（+）载体中进行诱导表达。通过SDS-PAGE、镍柱亲和层析和免疫印迹法鉴定表达蛋白,利用间接免疫荧光对ADP/ATP转运蛋白的分布进行检测。【结果】家蚕微孢子虫的ADP/ATP转运蛋白编码序列（GenBank登录号为EOB13854.1）全长1 524 bp,编码蛋白含有507个氨基酸残基,预测分子质量为59 kDa,等电点为9.35。具有12个跨膜结构域和TLC结构域,其中TLC结构域含有4个功能保守位点。与蜜蜂微孢子虫的ADP/ATP转运蛋白比较,氨基酸序列一致性达30%。系统进化分析表明微孢子虫ADP/ATP转运蛋白聚为一类,具有共同的起源。成功构建了NbADP/ATP-△TM-DHFR-pET30a原核表达重组质粒,目的基因获得表达,其融合蛋白分子量约为37 kDa,纯化重组蛋白并制备了多克隆抗体。免疫印迹分析表明,成熟微孢子虫中表达ADP/ATP转运蛋白;间接免疫荧光定位结果显示,家蚕微孢子虫孢子ADP/ATP转运蛋白定位于孢子质膜上。【结论】本研究将为阻断微孢子虫能量来源,达到控制和防治家蚕微粒子病提供新的思路。     

干旱胁迫对杠柳光合特性及抗氧化酶活性的影响

以盆栽杠柳幼苗为材料,用称重控水的方法设置4个含水量梯度,研究不同程度干旱胁迫对杠柳光合特性和抗氧化系统的影响,为黄河三角洲贝壳堤岛植被恢复过程中的物种培育和种植管理提供依据.结果表明:(1)随着干旱胁迫的加剧,杠柳幼苗叶片净光合速率(Pn)先增后降,蒸腾速率(Tr)和气孔导度(Gs)逐渐下降,胞间CO2浓度(Ci)先降后升,说明杠柳幼苗Pn下降在轻度干旱胁迫下主要是由气孔导度下降引起,而在重度胁迫下主要由非气孔因素引起.(2)随着干旱胁迫程度的加剧,杠柳幼苗瞬时水分利用效率(WUE)、表观光能利用效率(LUE)、羧化效率(CE)均呈现先增加后下降趋势;WUE在重度胁迫下才开始下降,比对照显著下降了39%,LUE(CE)则在中度胁迫下就开始下降,中度和重度胁迫分别比对照下降了48%(33%)、71%(69%).(3)随着干旱胁迫的加剧,杠柳叶片的超氧化物歧化酶(SOD)活性先升高后降低,过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)活性和MDA含量均逐渐增高,表明POD、CAT抑制杠柳叶片脂质过氧化效应不显著,SOD则抑制作用显著,且12.8%的贝壳沙含水量是SOD的耐受阈值,此时MDA含量比对照显著增加153%.