高等植物叶绿体基因工程

叶绿体基因工程作为一项新技术具有一系列传统核基因工程所不具备的优点,在基础性及应用性研究中极具吸引力,已经成功应用于了解质体基因组,调控植物代谢系统,农作物抗旱、抗虫、抗病、抗除草剂及以植物为生物反应器生产抗体、疫苗等方面的研究。本文主要介绍叶绿体基因工程的原理、操作体系及其在高等植物中的应用。     

毛白杨CCoAOMT cDNA片段的克隆与转基因杨木质素含量的调控

用RT_PCR方法从毛白杨 (PopulustomentosaCarr.)中克隆了CCoAOMT基因的cDNA片段 ,并对其序列进行了分析。Northern杂交表明该基因在毛白杨正在木质化的次生木质部高水平表达 ,且与木质化进程同步。构建了该基因反义表达载体 ,根癌土壤杆菌 (Agrobacteriumtumefaciens (SmithetTownsend)Conn)介导转化杂交杨 (欧洲山杨×银白杨 ,P .tremula×P .alba)。采用PCR、PCR_Southern及Southern杂交对获得的转基因植株进行分子检测 ,并测定移栽 5～ 6个月的转基因植株的Klason木质素含量 ,其中一个转基因株系的Klason木质素含量比未转基因对照杨树下降 17.9%。结果表明利用反义RNA技术对杨树CCoAOMT基因的表达可以降低转基因植株的木质素含量 ,达到改善其造纸性能的目的     

用于同工酶分析的细胞器中Ca2+-ATPase的低渗胀破提取法

将水稻叶片在ＰＨ７．８的ＳＴＮ介质中研磨、离心去细胞腑片,然后通过差速离心分别得到叶绿体、线粒体和细胞核。再通过加入等体积蒸馏水,在低温、低渗条件下,轻度研磨使之用,并在各自的保存液中液中浮,即可得到含在Ｃａ＾２＋－ＡＴＰａｓｅ的粗中供聚丙烯酰胺凝胶电泳之用。     

光敏胞质雄性不育小麦育性转换期叶片中NAD激酶和NADP磷酸酶的变化

由光敏感胞质雄性不育小麦育性转换敏感期叶片中NAD激酶和NAD磷酸酶的活性变化表明：在长光照（LD）处理下,光敏胞质雄性不育小麦（牡山羊草）白皮224在光敏感期,叶片中的NAD激酶总活性和钙调素非依赖性NAD激酶活性高于短日照处理。钙调素依赖NAD激酶则相反,在短日照（SD）条件下,其活性明显地高于LD处理。不育系在长日条件下钙调素依赖性和非依赖性NAD激酶活性的比例也发生了变化,其钙调素依赖性活性逐渐被钙调素非依赖性活性所取代。而可育系核供体白皮224在不同光照条件下,这类酶活性无明显的差异。至于NAD磷酸酶的活性变化,无论是光敏小麦成核供体白皮224在LD和SD下均呈下降趋势。     

高等植物叶绿体基因工程

叶绿体基因工程作为一项新技术具有一系列传统核基因工程所不具备的优点,在基础性及应用性研究中极具吸引力,已经成功应用于了解质体基因组,调控植物代谢系统,农作物抗旱、抗虫、抗病、抗除草剂及以植物为生物反应器生产抗体、疫苗等方面的研究.本文主要介绍叶绿体基因工程的原理、操作体系及其在高等植物中的应用.     

油菜叶绿体基因组同源重组片段的克隆及phb基因定点整合载体的构建

利用叶绿体基因组在进化过程中高度保守的特点,根据烟草、水稻和玉米叶绿体基因组全序列资料,设计合成引物,PCR扩增并克隆了油菜叶绿体两个重要的功能基因rbcL和atpB(GenBank登录号分别为AF267640和AF267641）,并以此作为定点整合源基因的同源重组片段。以来自叶绿体的强启动子PpsbA和Prrn等驱动PHB合成途径中3个关键酶基因phbA、phbB和phbC,分别构建表达盒,并将它们按照其在原始菌株中的自然转录顺序phbC-phbA-phbB相串联,最后连同选择标记基因aadA表达盒一起,克隆到油菜叶绿体同源片段中,构建成pgb基因定点整合载体pRCABZ和pRCABF.酶切及Southem杂交结果证明所构建的转化载体符合预期设计。叶绿体转化及后续工作目前正在进行之中。     

种子特异性启动子（napinB promoter）分离，表达载体构建及转基因植物获得

利用PCR技术从油菜Brassica napus H165基因组DNA中分离了napinB启动子,序列分析表明,扩增片段（nap300)与文献报道的napinB启动子相应区域的同源性为97％,将其与gus连接构建种子特异性表达载体,农杆菌介导转化烟草,PCR,Southern结果显示,nap300已整合到烟草基因组DNA,获得了转基因植株。     

二次转化获得整合phbA、phbＢ、phbＣ基因的转基因烟草

将携有导肽序列的phbB(编码乙酰乙酰CoA原酶）和phbＣ（编码ＰＨＢ合酶）连入pBIB-HYG得到组成型表达载体pZCB。用冻融法转入根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens(Smith et Townsend)Conn）并由其介导转化已整合且表达phbＡ（编码３－酮硫裂解酶）基因并具有卡那霉素抗性的转基因烟草（Nicotiana tabacum L.)。通过二次转化可避开传统杂交育种,在５个月内获得整合ＰＨＢ合成所需３个基因的转基因烟草。所获转基因植株表型正常,经ＰＣＲ、ＰＣＲ－Ｓouthern、RT-PCR-DNA交交检测确定有５０株烟草稳定整合phbＢ、phbＣ基因,其中６．６７％的植株可在转录水平表达双基因。