多囊体生物发生和蛋白质分拣——ESCRT、Vps4、Ubiquitination一个都不能少

多囊体(multivesicular body,MVB)是由晚期内吞体的限制膜内陷出芽而形成的动态的亚细胞结构,是真核细胞重要的膜和蛋白质运输与分拣中心,并与信号转导、胞质分裂、基因沉默、自噬、蛋白质的质量控制、病毒出芽等密切相关.多囊体生物发生涉及20多种囊泡分拣蛋白(Vps),最重要的是在内吞体膜上形成的4种内吞体运输分拣复合物(ESCRT 0、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)和Vps4.ESCRT 0与包涵素在内吞体膜上形成微域并富集泛素化的货物蛋白.ESCRTⅠ和Ⅱ诱导MVB囊泡出芽、促进囊泡形成并分拣货物蛋白到囊泡中.ESCRTⅢ收缩及剪切芽颈,完成最后的膜脱落过程.Vps4解离ESCRT以循环利用.泛素化及泛素化蛋白也能修饰或调控ESCRT的定位及功能.这些研究表明,泛素化蛋白、ESCRT和Vps4在内吞体膜上的相继协同作用是驱动紧密偶联的多囊体生物发生及蛋白质分拣的主要力量.本文以蛋白质-蛋白质相互作用为主,综述了ESCRT复合物及Vps4多聚体的组装机制、相互作用、生理功能以及泛素化蛋白和泛素化对ESCRT的调控,并对下一步研究进行了展望.     

美国破解病毒进入靶细胞的机理

美国西北大学生物学家殷献生博士研究组发现,一种能帮助病毒在人体内传播的蛋白质的结构,这种在“副流感病毒5型”的外层表面发现的蛋白质通常被叫做“融合蛋白”（fusion protein）,即所谓的“包膜”病毒,它可以将自身细胞膜与人体的细胞膜进行融解并感染。一旦细胞膜被融解,病毒就会将自身的基因物质倾注到健康的人体细胞中,并夺取人体细胞能量来进行病毒复制。     

囊泡运输调节机制的发现——2013年诺贝尔生理学或医学奖简介

细胞内特定蛋白质的靶向定位对于正常功能的发挥具有重要意义,而该过程由囊泡运输介导完成。谢克曼利用遗传学工具首先从酵母中筛选出多个囊泡运输相关基因;罗斯曼则用生物化学方法从哺乳动物细胞中鉴定出多个囊泡出芽和融合的相关分子并初步阐明其作用机制;苏德霍夫则发现钙离子调节突触囊泡释放神经递质的分子机制。这些研究拓展了对细胞内物质精确定位的理解,同时也更新了对部分疾病发生机制的认识。3位科学家由于"细胞内主要运输体系——囊泡运输调节机制的发现"而分享了2013年诺贝尔生理学或医学奖。     

杆状病毒介导外源基因在哺乳动物细胞中表达的研究进展

杆状病毒(Baculovirus)是一种以昆虫为唯一宿主的病毒, 可用做生物杀虫剂或作为表达载体在昆虫细胞中大量表达外源蛋白, 制备疫苗。研究发现, 在哺乳动物细胞中携带哺乳动物启动子的重组杆状病毒能启动下游外源基因的表达但病毒不能在哺乳动物细胞中增值, 对细胞毒性小, 转导成功的细胞可以稳定传代并有效表达外源基因, 哺乳动物细胞比昆虫细胞对蛋白质具有更好的翻译后修饰, 表达出的蛋白结构更接近天然蛋白。因此, 杆状病毒可作为一种新型的哺乳动物细胞基因转移载体, 用于表达外源基因及作为一种基因治疗载体, 具有巨大潜力, 日益受到人们的关注。本文对杆状病毒作为一种表达载体在哺乳动物细胞中表达的研究进展进行了综述。     

参与植物膜泡运输的蛋白质家族及功能研究进展

真核细胞的内吞和分泌途径中蛋白质和脂类的运输主要由膜泡运输介导。参与膜泡运输的蛋白质家族包括SNARE蛋白家族、RAB蛋白家族、被膜蛋白复合体、Sec1蛋白家族、Arf蛋白家族。这些蛋白质家族在进化中高度保守,并且在植物中已经鉴定了许多哺乳动物和酵母蛋白的同源物。近年来一些研究发现这些蛋白质不仅仅调节植物细胞的膜泡运输,还影响植物的许多生理活动和功能,例如向重性生长、胞质分裂、激素极性运输、气孔运动以及抗病性等。现主要阐述迄今在植物中研究这五类蛋白质家族功能的最新进展。     

小鼠P型ATP酶ATP8A2基因的克隆及其剪切亚型的分析

真核生物细胞各种膜结构两侧的磷脂分布是不对称的,这种不对称需要磷脂翻转酶的动态调节.目前认为这些酶可以分为三种,即爬行酶类、外翻酶类和内翻酶类,对于它们的研究才刚刚起步.P型ATP酶第四类亚型被认为有潜在的磷脂内翻酶活性,酵母全部5个该家族的蛋白质如DRS2p都陆续被确定了具有磷脂内翻酶的活性.对于酵母内翻酶的研究还发现该类蛋白质对于细胞极性建立和膜泡运输有重要作用.哺乳动物中由基因组比对发现有14个P型ATP酶第四类亚型成员,但对于它们的研究仅局限于病理方面.为了能够了解哺乳动物磷脂内翻酶在细胞内活动的分子机制,克隆了酵母DRS2p在哺乳动物中的同源物ATP8A2的编码基因,并发现了它的两种剪切亚型.通过对它们的组织分布分析,发现该蛋白质主要分布在睾丸中,提示它可能对于精子的发生有一定功能.     

解脂耶氏酵母中囊泡蛋白YlSec15的鉴定及功能研究

解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)进行出芽繁殖时,决定未来分裂平面的出芽位点不是随机选取的,而是选择在前一次细胞分裂位置的对侧出芽,即进行双极出芽。目前对解脂耶氏酵母双极出芽的分子调控机制并不清楚。通过观察蛋白定位及过量表达的方法研究了解脂耶氏酵母中囊泡蛋白YlSec15的功能。结果表明:YlSec15在细胞中有明显的极性定位,在细胞的小芽内以及大中芽的芽颈处富集,过量表达YlSec15抑制了菌丝的形成并使得部分细胞的出芽位点选择方式由双极出芽转变为随机出芽,而引起这一变化的原因可能是由于过量的YlSec15在细胞中不能进行正常的极性定位。此外,YlSec15可能是通过YlRas2介导的信号通路参与调控细胞的菌丝形成及双极出芽。这一发现丰富了解脂耶氏酵母中双极出芽的分子调控机制,也证明了极性生长与囊泡运输之间是相互影响的。     

HIV-1 B亚型gag基因密码子优化及其免疫原性的研究

从河南HIV-1流行区感染者中克隆HIV-1 B亚型gag基因,通过序列比对获得其一致性共有序列,对该共有序列按照哺乳动物优势密码子的使用原则进行优化,以Western blot方法比较优化前后gag基因体外表达量.发现对gag基因进行密码子优化可显著提高其表达水平.将优化后的mod.gag基因插入重组腺病毒载体,构建了重组病毒rAdV-mod.gag.在BALB/c小鼠体内分别以108PFIJ及108PFU rAdV-mod.gag疫苗单独免疫两次均可产生较高水平的gag特异性细胞免疫反应.由此得出结论,对gag基因的密码子优化是成功的;表达优化后gag基因的重组腺病毒疫苗,可以在小鼠体内诱导较强的gag基因特异性CTL应答.     

囊泡运输的分子细胞机制

内膜系统构成了细胞及细胞器之间的天然屏障,保证重要的生命活动在相对独立的空间内进行。细胞内膜性细胞器之间的物质(如蛋白质、脂类)的运输主要是通过囊泡完成的。囊泡运输需要货物分子、运输复合体、动力蛋白和微管等的参与以及多种分子的调节,包括出芽、锚定和融合等过程。从上世纪60年代开始,人们认识到细胞分泌的蛋白需要先进入内质网,再到高尔基体,然后分泌到其作用部位。之后,信号肽假说被提出和证明。随后的研究完善了囊泡运输的过程,包括经内质网到高尔基体的蛋白质分泌运输过程中关键的调控基因及其作用环节、蛋白质复合物SNARE(可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感的融合蛋白附着蛋白受体)在囊泡锚定和融合中的作用机制等。在囊泡运输中的具有代表性的神经细胞突触囊泡中,触发突触囊泡融合的钙感受器(synaptotagmin)能快速准确地将钙信号传递到突触囊泡,通过与SNARE复合体等作用,实现与细胞膜融合并释放神经递质,最终完成神经信息的传递。该文从囊泡运输的研究历史回顾、已有研究成果以及未来展望等三个方面对囊泡运输分子细胞机制进行了阐述。     

Rab 蛋白调控胞内囊泡运输

细胞内各个细胞器之间通过囊泡的膜转运是真核细胞存在的基本。Rab蛋白确保了转运蛋白被运输至正确的目的地。Rab蛋白是小GTP酶中的一大家族,它通过募集其效应物蛋白,其中包括接头蛋白,栓系因子,激酶,磷酸酶以及动力蛋白等,调控了细胞膜的选取,囊泡出芽,去包被,转运以及膜融合等过程。本文主要从Rab蛋白循环着手,依次论述了Rab蛋白在囊泡出芽,去包被,转运和膜融合等过程中起到的作用,从而使读者对Rab蛋白能有一个更加系统的了解。     

携带HIV-1抗原的单纯疱疹病毒载体疫苗的构建及鉴定

利用细菌人工染色体技术将串联的HIV-1 gp160、gag和protease基因以及表达元件插入1型单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus type 1,HSV-1)内部反向重复序列区,以获得携带HIV-1抗原的单纯疱疹病毒载体疫苗。首先将HIV-1 gp160(B型和C型)、gag和protease基因串联克隆入pc DNA3获得重组质粒pc DNA/g Bgp和pc DNA/g Cgp,重组质粒转染293FT细胞,Western blotting检测HIV抗原表达。继而将pc DNA/g Bgp和pc DNA/g Cgp中包括HIV-1抗原基因和表达元件的表达框克隆入p KO5/BN获得重组穿梭质粒p KO5/BN/g Bgp和p KO5/BN/g Cgp,穿梭质粒电转含BAC-HSV的大肠杆菌,筛选重组菌,提取重组DNA并转染Vero细胞,挑取病毒蚀斑纯化重组病毒,Southern blotting鉴定重组病毒DNA,Western blotting检测重组病毒感染细胞中HIV抗原表达,并分析病毒的增殖特性。结果表明,Western blotting在pc DNA/g Bgp和pc DNA/g Cgp转染的293FT细胞中检测到表达的gp160和gag蛋白。p KO5/BN/g Bgp和p KO5/BN/g Cgp分别电转获得重组菌,并从重组DNA转染的Vero细胞中纯化获得重组HSV,Southern blotting检测表明重组HSV基因组发生特异性重组,重组病毒感染细胞中检测到gp120和gp41,且重组HSV保留了在哺乳动物细胞中的复制能力。本研究获得携载HIV-1 gp160、gag和protease基因的重组HSV,并保留了在哺乳动物细胞中的复制能力,可作为HIV-1复制型病毒载体疫苗。     

新型抗原递送载体:细胞溶素A融合目的蛋白整合的重组外膜囊泡的构建与鉴定

细菌外膜囊泡(OMVs)是革兰氏阴性菌以出芽方式分泌的一种蛋白脂质体,可通过基因工程改造成为外源大分子抗原蛋白的载体。成孔蛋白细胞溶素A(Cly A)可作为引导序列将C-端融合的外源蛋白质定位在菌体及其所分泌的OMVs外膜上。利用Cly A融合蛋白重组的OMVs可介导抗原呈递,制备疫苗。为验证这一假说,本研究拟以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为目的蛋白,采用重组技术,构建Cly A-EGFP融合蛋白表达载体,转化E.coli DH5α,获得Cly A-EGFP融合蛋白整合的重组细菌OMVs,探索Cly A/EGFP融合蛋白整合的OMVs作为一种制备新型疫苗载体的可行性。重组OMVs分别经蛋白酶K和/或EDTA处理后,蛋白质印迹分析显示,Cly A-EGFP融合蛋白有效地整合在重组的OMVs中,且EGFP呈现于表面。重组OMVs与小鼠巨噬细胞Raw264.7共同孵育后,以EGFP作为标记,荧光显微镜观察显示,OMVs可被巨噬细胞吞噬、摄取。进而,荧光显微镜及流式细胞术分析证明,重组的OMVs可被骨髓来源的树突状细胞(BMDCs)有效摄取,并促进BMDCs表达CD86和CD80,说明重组的OMVs可激活树突状细胞,促进其成熟。本研究结果提示,利用Cly A融合特异目的蛋白整合的重组OMVs,可作为外源蛋白质的载体,介导抗原呈递作用,在设计与制备疫苗中具有潜在的应用价值。     

COPⅠ囊泡形成与结构研究进展

真核细胞内物质的转运主要通过运输囊泡的出芽、融合所介导。外被体蛋白Ⅰ(coat proteinⅠ,COPⅠ)是一种由α、β、β'、γ、δ、ε、ζ亚基组成的异七聚体蛋白质复合物(即coatomer)。细胞内具有小GTP酶活性的ADP-核糖化因子1(ADP-ribosylation factor 1, Arf1)调节COPⅠ囊泡(COPⅠ-coated vesicle)的形成。在鸟苷酸交换因子的作用下,活化的Arf1-GTP结合至高尔基复合体(Golgiapparatus,Golgi)膜上,将胞质中的COPⅠ募集到膜上。COPⅠ在膜表面结合、分选货物、聚合装配,使膜弯曲产生包被的出芽,出芽逐渐增长最终与膜分离形成囊泡。COPⅠ囊泡进一步脱壳、与靶膜融合,进而完成对细胞内物质的转运。COPⅠ囊泡可携带蛋白质和脂质等货物分子从Golgi逆向转运至内质网(endoplasmic reticulum, ER),并介导Golgi膜囊间物质的逆向和正向运输过程,维持Golgi结构的极性与膜囊的成熟。     

酵母Dop1及其同源蛋白DOPEY对细胞糖基化和囊泡运输影响的研究

蛋白质糖基化是一种保守的翻译后修饰,对多种细胞现象至关重要。在酵母或动物细胞高尔基体中的糖链处理由结构相似的糖基转移酶或糖苷酶催化。囊泡运输等多种因素会影响糖基转移酶在高尔基体中的稳态定位,进而影响糖基化。该研究探讨高尔基外周蛋白Dop1对细胞糖基化和囊泡运输的影响。共聚焦荧光显微镜活细胞成像显示,Dop1主要定位于晚期高尔基体。Dop1及其相互作用蛋白Neo1(P4 ATPase)均参与高尔基体后期的囊泡运输。此外,Dop1介导糖基转移酶Och1的逆向运输而影响糖基化。进一步,哺乳动物DOPEY1和DOPEY2是酵母Dop1的同源蛋白。DOPEY1或DOPEY2的缺失导致高尔基体结构的改变,轻微地影响细胞糖基化。综上,酵母Dop1和哺乳动物DOPEY都参与了细胞后期的蛋白质囊泡运输,并影响高尔基体形态或糖基化。     

HIV-1gag/IFNα-2b的构建与表达鉴定

目的：构建艾滋病病毒核心蛋白(gag)与干扰素(IFNα-2b)融合基因表达质粒,观察其在痘苗病毒中共表达结果,研究其意义。方法：利用基因重组技术,将IFNα-2b基因片段插入到gag基因的nt531位点,经脂质体转染与血凝素阴性蚀斑筛选,挑出重组痘苗病毒。经免疫荧光、Western blot和Dot-ELISA鉴定表送产物。结果：间接免疫荧光实验结果显示,转染重组质粒的细胞表面有绿色荧光。免疫印迹实验与Dot-EILSA结果均显示重组质粒转染细胞的裂解物中存在表达的gag／IFNα-2b蛋白。结论：成功地构建了重组真核细胞表达质粒,表达的蛋白具有良好的免疫原性与免疫反应性。     

猴免疫缺陷病毒引起多形核嗜中性白细胞凋亡的可能机理

本实验目的是研究猴免疫缺陷病毒（SIV）引起多形核嗜中性白细胞（PMNs）凋亡的机理。实验用PCR技术扩增gag基因,用Western blot法测定p53和bcl-2基因的表达。结果显示PMNs在被SIV感染后随着保温时间的延长存活率下降,在感染后24h可以从PMNs中扩增出gag基因。PMNs中p53基因的表达在感染后24h增加。同时bcl-2基因的表达在对照组和SIV感染组都增加,但在SIV感染组bcl-2蛋白的表达明显低于对照组。结果揭示SIV能够感染PMNs,p53和bcl-2基因表达的改变可能是SIV感染PMNs引起细胞凋亡的机理。     

昆虫杆状病毒应用于哺乳动物基因治疗的研究进展

杆状病毒是一类宿主特异性的昆虫病毒。昆虫杆状病毒表达系统是一个高效的真核表达系统,被广泛用于在昆虫细胞或昆虫幼虫中生产外源蛋白质。杆状病毒不能感染哺乳动物,却可以进入不同物种和组织来源的多种哺乳动物细胞,并在合适的哺乳动物启动子控制下表达外源基因。杆状病毒在哺乳动物细胞中不能复制,对细胞没有毒性,加上杆状病毒本身具有基因组大、可操作性好等优点,作为哺乳动物基因治疗的载体,将治疗基因传递给哺乳动物细胞已受到了广泛关注。在此就杆状病毒作为基因治疗载体的最新研究进展进行了阐述并探讨其发展趋势。     

猴免疫缺陷病毒引起多形核嗜中性白细胞凋亡的可能机理

本实验目的是研究猴免疫缺陷病毒(SIV)引起多形核嗜中性白细胞(PMNs)凋亡的机理.实验用PCR技术扩增gag基因,用Western blot法测定p53和bcl-2基因的表达.结果显示PMNs在被SIV感染后随着保温时间的延长存活率下降,在感染后24h可以从PMNs中扩增出gag基因.PMNs中p53基因的的表达在感染后24h增加.同时bcl-2基因的表达在对照组和SIV感染组都增加,但在SIV感染组bcl-2蛋白的表达明显低于对照组.结果揭示SⅣ能够感染PMNs,p53和bcl-2基因表达的改变可能是SⅣ感染PMNs引起细胞凋亡的机理.     

猴免疫缺陷病毒引起多形核嗜中性白细胞凋亡的可能机理（英文）

本实验目的是研究猴免疫缺陷病毒(SIV)引起多形核嗜中性白细胞(PMNs)凋亡的机理.实验用PCR技术扩增gag基因,用Western blot法测定p53和bcl-2基因的表达.结果显示PMNs在被SIV感染后随着保温时间的延长存活率下降,在感染后24h可以从PMNs中扩增出gag基因.PMNs中p53基因的的表达在感染后24h增加.同时bcl-2基因的表达在对照组和SIV感染组都增加,但在SIV感染组bcl-2蛋白的表达明显低于对照组.结果揭示SⅣ能够感染PMNs,p53和bcl-2基因表达的改变可能是SⅣ感染PMNs引起细胞凋亡的机理.     

一种使哺乳动物细胞中rDNA增强表达的启动子

如果要找到一种可增强哺乳动物细胞中重组体蛋白的表达水平的方法,不妨试试一个新发现的启动子,它能提高哺乳动物细胞中基因的表达水平。该启动子是通过重组体 DNA 技术与另一种基因偶联在一起的。实际上,它(用于β肌动蛋白的开关)可能是一些最有用的启动子中的一种,因为它能控制β肌动蛋白(哺乳动物细胞中最有用蛋白中的一种)的产生。据发表于1985年10月的一份《美国国家科学院院报》杂志报道,斯坦福大学医学院(斯坦福’