一种新的DNA分子克隆方法

DNA分子克隆是基本的分子生物学实验技术,传统的分子克隆方法大多需经过酶切链接过程,但在某些情况下,没有合适的酶切位点往往会成为阻碍克隆进行的障碍.本文描述了一种新的分子克隆方法,称为不依赖酶切和链接的分子克隆（RLIC）.利用RLIC,将3种不同大小的DNA片段克隆到3种不同载体,证明了这种方法的有效性和可靠性.由于该方法不受限制性酶切序列限制,省去了酶切连接步骤,因此具有很大的灵活性和简便性,在分子生物学研究方面有广泛应用前景.     

外切核酸酶Ⅲ介导的DNA分子克隆

DNA克隆技术,作为最基本的现代分子生物学实验技术之一, 已经成为生物医学研究领域的重要研究手段。传统的分子克隆方法需要经过限制性内切酶酶切和DNA连接酶连接的步骤,是否存在合适的酶切位点和DNA连接酶的效率成为影响克隆的重要限制因素。本文描述了一种由外切核酸酶Ⅲ介导的,以3′-5′外切核酸酶活性和细菌细胞内DNA修复机制为理论基础的DNA分子克隆方法,称为不依赖连接酶的分子克隆（ligation-independent cloning, LIC）|证明了该方法的高效性和可靠性,并进一步对酶的用量、反应温度、反应时间、片段载体比例和量等多个参数进行了优化,建立了一种快速、简便和高效的DNA克隆方法。     

生物催化剂在手性药物合成中的应用

基因表达及功能分析需要高通量的表达系统,因而简单、经济且高效地将PCR产物或其他来源的目的基因片段构建到质粒载体中就成为了亟需解决的问题.传统克隆方法使用限制性内切酶和连接酶,其缺点是受到基因序列中原有的酶切位点的限制以及依赖连接酶导致的较低的连接转化率.为了克服这些缺点,一些不需要限制酶和连接酶的克隆方法被开发出来并运用到基因克隆中,获得了更佳的实验结果.该文就LIC、UDG克隆和Gateway重组克隆这三种不依赖连接反应的高通量克隆方法的原理及特性进行介绍.     

鳞翅目基因组IIB型内切酶位点的统计分析

IIB型限制内切酶能够识别并切割特异酶切位点两端特定距离的DNA,形成粘性末端的30 bp左右的等长DNA片段。利用其特性与限制性酶切位点关联测序技术(RAD)相结合发展出2b-RAD简化基因组测序技术,应用于遗传图谱构建、种群遗传结构分析、性状定位以及细菌分型等多种研究领域。构建2b-RAD测序文库之前,需要对基因组中的IIB型限制内切酶位点进行预测与统计分析,制定有效的测序文库构建方案。本文利用Python语言构建分析基因组中IIB型限制内切酶位点的流程,预测并统计6个鳞翅目代表物种基因组含有的8个商业化IIB型限制内切酶的酶切位点,比较了各个基因组与IIB型限制内切酶之间含有的酶切位点总量、重复序列数量以及酶切间隔长度的关系,为在昆虫基因组中进一步试行2b-RAD研究提供了参考。     

大肠杆菌AS1.76青霉素G酰化酶基因的克隆和定位

通过DNA体外重组,由E. colt AS 1.76菌株染色体DNA获得了青霉素G酰化酶基因克隆。测定了pPGA20质柱的限制性内切酶图谱,并构建了若干个pPGA2(／的变种。这些变种的酶活力及其酶切位点关系的分析结果表明,青霉素G酰化酶基因定位在 HindIII 和Sinai酶切位点之间小于2．8Kb DNA片段上。     

黄鳝Sox9基因的克隆及其鉴定分析

Sox9基因在人和多种动物中具有进化保守性,在性别决定过程中发挥着重要作用。通过对黄鳝Sox9基因的分子克隆及其限制酶切分析,确定了该克隆的限制酶图谱。从限制酶片段的PCR分析以及HMG盒的DNA序列测定,鉴定该阳性克隆为黄鳝Sox9基因克隆,黄鳝Sox9基因的克隆进一步说明Sox9基因在进行上的高度保守性,对其基因组DNA和cDNA序列结构和转基因黄鳝的深入研究,无疑有助于从进化上阐明Sox9基因功能。     

镜像克隆系统:DNA重组技术的新进展

镜像克隆系统是近几年新发展起来的一种DNA重组技术,它突破了传统重组限制酶切及连接的繁琐和费时,利用重组酶使外源基因快速、方便地进行亚克隆和表达。本阐述了镜像克隆系统的结构、作用原理及特点。     

无限制克隆技术研究进展及其应用

无限制克隆(restriction-free cloning,RFC)是近年来建立起来的一种简单通用的DNA克隆技术,它可以精确地将目的片段插入到质粒内任意位置,是一种不受酶切位点、连接酶效率、目的基因长度或载体序列等条件限制的新型DNA重组技术.与其他多种克隆方法相比,RFC技术拥有不可替代的优势.本文在总结国内外RFC技术研究的基础上,系统阐述了RFC技术的原理、特点和在克隆方面的研究进展,并探讨其在分子生物学和合成生物学等领域的应用价值.     

一种新型的基因定点突变方法及其在DdsA突变研究中的应用

为了发展基因突变技术,介绍一种新型的基因定点突变方法.该方法巧妙利用了基因序列中广泛存在的不完整的平端酶切位点.与传统方法相比,可以迅速地在全基因的任何部位替换核苷酸,并可以在突变实验过程中直接将目的基因克隆到T载体上,便于测序及进一步克隆.利用该方法成功地获得了DdsA（decaprenyl diphosphate synthase,十聚异戊二烯焦磷酸合成酶）在4个氨基酸位点上的19个变体酶.这些位点分布在基因的不同区域内.证明这种新方法的高效性.     

寻找克隆基因的探针

基因表达和DNA复制应用到基因克隆的具体方法和技术及其概念在不断发展变化。首先DNA是应用纯化了的限制性内切酶在核酸序列上的特异部位切割下来的DNA片段,许多DNA片段用DNA连接酶把它们拼接成克隆工具。限制性内切酶和DNA连接酶在进行筛选时已加以纯化了,这两种酶在商业上是有价值的。     

艾滋病病毒蛋白酶高效表达载体及体外活性检测系统的构建

艾滋病是本世纪80年代初发现的一种烈性传染病,5年病死率为100％,致病因子为人免疫缺陷病毒,该病毒的蛋白酶在病毒复制和成熟中具有决定性的意义。由于目前国内外尚未获得艾滋病病毒蛋白酶的高效表达的重组子及活性检测系统,限制了它的研究与应用。本文利用PCR技术修饰了艾滋病病毒蛋白酶的基因,使其具有便于克隆及表达用的限制酶切位点及转录终止码,井在其C末端设置了一个可用于检验该酶活性的特殊序列。DNA序列分析揭示上述突变策略成功,将修饰后的艾滋病病毒蛋白酶基因克隆入大肠杆菌表达系统,并获得高效表达(>30％),Western-Bolt鉴定结果表明所表达的蛋白为艾滋病病毒所特有,并具有较好的生物活性。     

基于抗性恢复的高效克隆超短片段重组质粒的构建

分子克隆作为一种常规技术被广泛应用于DNA及蛋白质的研究。在传统的分子克隆中,主要通过限制性内切酶先分别消化目的 DNA片段及载体,再纯化回收,然后用DNA连接酶将二者连接。而对一些超短基因片段(300 bp),通过酶切及切胶纯化后,回收率极低,导致插入表达载体比较困难。文中介绍了一种新的利用质粒抗性恢复进行克隆的方法,大大提高了克隆效率,为短基因片段的分子克隆提供了一种高效的方法。     

应用PCR技术定向引入DNA小片段的策略

描述一种应用PCR技术定向引入DNA小片段和特异酶切位点的方法。为了获得m2/loxp66EGFPloxp71基因片段。根据EGFP基因序列,设计一对特异引物,上、下游引物分别引入m2/loxp66、loxp71序列和Xhol、Mlu1酶切位点。以pEGFPN1质粒为模板,采用PCR扩增以合成DNA双链,插入到克隆载体pMD18T。对重组子测序结果表明,实现了DNA小片段和酶切位点的定向引入。     

水稻功能基因图位克隆研究进展

图位克隆是建立在植物分子标记图谱之上的一种基因克隆技术。利用分子标记技术对目的基因进行精细定位,用与目的基因紧密连锁的分子标记筛查DNA文库,构建包含目的基因区域的物理图谱,通过染色体步移等方法找到包含目的基因的克隆,再通过遗传转化试验对目的基因进行功能验证。介绍了基因图位克隆的研究技术原理与技术环节,并对近年来水稻功能基因图位克隆研究进展进行了综述。     

酵母表面展示T载体构建及目的蛋白的表面展示

构建一种能对PCR产物进行直接克隆并展示于酵母表面的新型T载体。根据酵母表面展示载体p YD1多克隆位点序列设计出利用两端带有XcmⅠ内切酶酶切位点的含有黄色荧光蛋白基因的XcmⅠ酶切盒,通过NheⅠ和XhoⅠ酶切位点插入到p YD1载体上形成质粒p YD-YFP,并对其进行酶切鉴定和DNA测序分析,再经XcmⅠ酶切后形成两端带有d T的表面展示T载体。利用PCR扩增两个含有荧光蛋白的融合蛋白PCAD-CFP和PSR-Ds Red的基因并直接克隆到所构建的T载体中,检测其表达功能。酶切鉴定和DNA测序结果显示PCAD-CFP和PSR-Ds Red正确插入载体上,分别转化至酿酒酵母EBY100中,激光共聚焦显微镜下观察到相应的荧光的酵母,表明克隆有融合蛋白基因片段的载体成功在酵母细胞中进行表面展示,证明了所构建的酵母表面展示T载体具有直接克隆和表面展示目的蛋白的功能。     

利用同序异尾限制性内切酶快速克隆多基因片段的新方法

介绍一种可以快速进行多基因片段克隆的新方法——同序异尾限制性内切酶(isoschizomer-heterotailrestrictionendonuclease,IHRE)一步克隆法,该方法可以一步完成多达6个DNA片段的连接,具有简单快速、节省试剂、成功率高、不引入非目的基因序列等很多优点.应用该方法已经成功完成对人肠激酶轻链多基因克隆、HSV多表位DNA疫苗的构建等.     

利用多模板Y形接头延伸法进行相邻序列的连续扩增

Y形接头延伸法(Y-shaped adaptor dependent extension,YADE)是一种扩增已知DNA片段相邻序列的方法,但其效率常受到已知序列周围酶切位点数目的限制。在Y形接头延伸中采用由多种酶切和连接产生的DNA作模板,大大提高了该方法扩增相邻序列的效率,实现了相邻序列的连续扩增。利用该方法通过2轮连续的扩增从7种酶切连接产物中成功地获得了1个棉花小GTP酶基因(GhRacB)的2228bp上游序列。结果表明,多模板Y形接头延伸法是一种从复杂基因组中扩增相邻序列的有用方法。     

发育特异基因及其在RNA水平上的表达

从λ噬菌体gtll的cDNA表达文库筛选到7个胡萝卜体细胞发育特异的基因克隆,并对它们进行了纯化、分离噬菌体DNA,限制酶消化,琼脂糖凝胶电泳鉴定,以及将cDNA插入片段再克隆到pIBI或p^Uc18质粒等处理。然后,通过Southern blot分析,证明克隆16,22,50及60等为新的cDNA基因。此外,又通过Northern blot分析测定了这些基因的组织特异性表达及时序表达。结果表明,克隆22是一种受发育调节,与胡萝卜体细胞胚胎形成密切相关的基因。     

淀粉酶链霉菌BAC基因组文库的构建及鉴定

提取淀粉酶链霉菌SM33基因组DNA,用Hind III部分酶解后回收40 kb～60 kb大小的高分子量DNA,与质粒载体pIndigoBAC536连接,电击转化EPI300感受态细胞,经蓝白斑筛选共挑取了5 184个白色克隆.从文库中随机挑选10个克隆,酶切检测平均插入片段约为50 kb,覆盖了32.4倍基因组.并且插入片段均具有9～15个Not I酶切位点,符合链霉菌基因组特征.通过对BAC文库的筛选,获得苹果酸脱氢酶基因(mdh)的保守序列,与已知的链霉菌mdh具有很高的相似性.淀粉酶链霉菌BAC基因组文库的建立,对基因克隆、基因组物理图谱、次级代谢途径、新抗生素的发现以及工业用酶的应用等研究均有重要意义.     

利用DREAM设计和同源重组进行一步定点突变

目的：建立基于DREAM设计和同源重组的简便、快速定点突变方法。方法：设计两条包含突变的反向PCR（inverse PCR）引物,使其5'端互补从而产生同源重组,同时使用DREAM设计方案在上述引物中引入限制性内切酶位点以便突变子筛选。用能扩增长片段的高保真耐热 DNA聚合酶扩增全长的质粒DNA,直接转化大肠杆菌。转化到细菌中的全长质粒DNA PCR产物可利用其末端同源序列发生同源重组而环化。利用引入的酶切位点方便地进行突变子的筛选。结果：我们用该方法成功地对长度大于7 kb的质粒进行了定点突变。结论：本定点突变无需任何突变试剂盒和特殊的试剂,只需一步反应即可完成;利用DREAM设计使克隆筛选简便可靠,高保真耐热DNA聚合酶可保证多数突变子克隆不发生意外突变,而该酶扩增长片段的能力使该方法适合于大多数质粒不经亚克隆直接突变。