基于第三代长读段测序数据解析蜜蜂球囊菌基因的可变剪切与可变腺苷酸化

【目的】蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis,简称球囊菌)是一种专性侵染蜜蜂幼虫的真菌病原,导致的白垩病是严重影响养蜂生产的顽疾,每年给养蜂业造成较大损失。本研究旨在基于已获得的第三代长读段测序数据对球囊菌菌丝(Aam)和孢子(Aas)中基因的可变剪切(alternative splicing,AS)和可变多聚腺苷酸化(alternative polyadenylation,APA)进行深入分析。【方法】利用Astalavista软件鉴定Aam和Aas中基因的AS事件类型。利用IGV浏览器对部分剪切异构体(isoform)的结构进行可视化。通过TAPIS pipeline对Aam和Aas中基因的APA位点进行鉴定。通过MEME软件对Aam和Aas中全长转录本的APA位点上游50bp的序列特征进行分析并对motif进行鉴定。【结果】在Aam中共鉴定到286次AS事件,包括162次RI(Retained intron),87次A3(Alternative 3'splice-site)、32次A5(Alternative 5'splice-site)和5次SE (Skipping exon);在Aas中共鉴定到559次AS事件,包括305次RI、155次A3、85次A5、13次SE和1次MEE (Mutually exclusive exon)。进一步分析发现,现有参考基因组上的多数注释基因结构并不完整;部分注释基因在菌丝和孢子中转录形成的isoform在数量和结构方面均存在差异;部分isoform在参考基因组中没有对应的注释基因。Aam中共鉴定到2748个基因含有1个及以上的APA位点,其中含有1个APA位点的基因数量最多(726,26.42%);Aas中共鉴定到2768个基因含有1个及以上的APA位点,其中含有5个以上APA位点的基因数量最多(1180,42.63%)。部分基因在菌丝和孢子中含有不同的APA位点数。序列特征分析结果显示,球囊菌全长转录本的3'UTR的上下游表现出明显的碱基倾向性,U和A分别富集在3'UTR的上游和下游。此外,在球囊菌全长转录本的APA位点上游鉴定到4个motif,分别是UCUCCU、UCUUCU、CCCACC和CCCCCU。【结论】本研究通过对球囊菌菌丝和孢子中基因的AS和APA进行深入分析,揭示了球囊菌转录组的复杂性,为完善现有的基因组和转录组注释提供了宝贵信息,也为探究AS和APA在球囊菌的基因表达调控中的作用提供了关键基础。     

蜜蜂球囊菌菌丝和孢子中毒力因子相关全长转录本的鉴定及分析

[目的]蜜蜂球囊菌Ascosphaera apis是一种专性侵染蜜蜂幼虫而导致白垩病的致死性真菌病原.基于前期已获得的高质量纳米孔(Nanopore)长读段测序数据,对蜜蜂球囊菌菌丝(AaM)和孢子(AaS)中的毒力因子相关全长转录本进行鉴定和分析,为毒力因子相关剪接异构体的功能研究提供参考信息和基础.[方法]利用BLAST工具,将AaM和AaS中的所有全长转录本比对Nr数据库,以鉴定蜜蜂球囊菌的毒力因子(几丁质酶、脂肪酶、水解酶和蛋白酶)相关的全长转录本.使用minimap2软件,将AaM和AaS中的全长转录本序列与蜜蜂球囊菌参考基因组注释的已知转录本序列进行比对,将比对到参考基因组的全长转录本进行归一化处理,再通过每百万计数法(Counts per million,CPM)计算毒力因子相关全长转录本的表达量.利用百迈克云平台的相关工具绘制转录本的表达量聚类热图.通过IGV浏览器对部分毒力因子相关全长转录本结构进行可视化.[结果]在AaM鉴定到毒力因子相关的367个基因及407个全长转录本,包括12条几丁质酶相关全长转录本,48条脂肪酶相关全长转录本,289条水解酶相关全长转录本,58条蛋白酶相关全长转录本.在AaS鉴定到毒力因子相关367个基因及400个全长转录本,包括14条几丁质酶相关全长转录本,63条脂肪酶相关全长转录本,267条水解酶相关全长转录本,56条蛋白酶相关全长转录本.另外,AaM和AaS特有的毒力因子(几丁质酶、脂肪酶)相关全长转录本分别有0条和17条,共有的毒力因子相关全长转录本有60条.进一步分析发现,蜜蜂球囊菌的部分毒力因子基因可通过可变剪接形成多条剪接异构体.[结论]共鉴定到蜜蜂球囊菌毒力因子(几丁质酶、脂肪酶、水解酶和蛋白酶)相关的367个基因和486条全长转录本;相比于蜜蜂球囊菌参考基因组注释的转录本,绝大多数毒力因子基因对应的全长转录本数量更多且结构更为复杂.研究结果丰富了蜜蜂球囊菌毒力因子相关基因和转录本的注释信息,为毒力因子相关剪接异构体的功能研究提供了基础,也为白垩病防控提供了潜在靶点.     

基于PacBio测序数据的蜜蜂球囊菌转录因子、融合基因及RNA编辑事件的鉴定

【目的】本研究旨在利用已获得的PacBio单分子实时(single molecule real-time, SMRT)测序数据对蜜蜂球囊菌Ascosphaera apis菌丝(AaM)和孢子(AaS)中的转录因子(TF)、融合基因和RNA编辑事件进行鉴定和分析,以期丰富蜜蜂球囊菌的相关信息,并为进一步探究它们的功能提供理论依据。【方法】利用BLASTx工具将AaM和AaS的全长转录本序列比对到Nr, Swiss-Prot和KEGG数据库以获得一致性最高的蛋白序列,再利用hmmscan软件将上述蛋白序列比对到Plant TFdb数据库以获得TF的分类及注释信息。采用TOFU软件中的fusion_finder.py程序进行融合基因的预测,进而分析融合基因的序列和位置信息。使用SAMtools预测AaM和AaS中的RNA编辑事件,再利用ANNOVAR软件对RNA编辑事件进行注释,进而采用相关生物信息学软件对RNA编辑位点基因进行GO功能和KEGG通路注释。【结果】在AaS中共鉴定到17个TF家族的213个TF,其中C2H2家族包含的TF成员最多。在AaM和AaS中分别鉴定到921和510个融合基因,二者共有的融合基因为510个,特有的融合基因分别为411和0个。在AaM和AaS中分别鉴定到547和191次RNA编辑事件,其中AaM中同义单核苷酸突变的数量最多,AaS中非同义单核苷酸突变的数量最多。此外,在AaM中鉴定到12种碱基替换类型,其中发生C->T的RNA编辑事件数量最多,达到158次;在AaS中鉴定到9种碱基替换类型,其中发生C->T和G->T的RNA编辑事件数量最多,均有42次。AaM和AaS中RNA编辑位点基因分别涉及19和24个GO功能条目;此外还能注释到11和20条KEGG通路。【结论】蜜蜂球囊菌的菌丝和孢子中含有丰富的TF、融合基因和RNA编辑位点;转录因子C2H2家族与蜜蜂球囊菌菌丝和孢子的生长发育和细胞活动具有潜在关联;RNA编辑事件的碱基替换类型在蜜蜂球囊菌和其他物种中具有物种特异性;RNA编辑可能在蜜蜂球囊菌菌丝和孢子的生长和代谢中发挥作用。     

蜜蜂球囊菌的参考转录组de novo组装及SSR分子标记开发

【目的】通过RNA seq技术对纯培养的蜜蜂球囊菌Ascosphaera apis孢子和球囊菌侵染的蜜蜂幼虫肠道组织进行测序,de novo组装球囊菌的参考转录组,并对其进行功能与代谢通路注释,进而基于该转录组数据开发球囊菌的SSR分子标记。【方法】首先通过差速离心获得活化的球囊菌孢子,配制含1×107孢子/m L的饲料饲喂4,5和6日龄的意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica幼虫和中华蜜蜂Apis cerana cerana幼虫,通过Illumina Hi SeqTM2500平台同时对上述蜜蜂幼虫肠道及纯化球囊菌孢子进行深度测序,原始数据过滤后通过Trinity软件组装得到unigenes,进而通过BLASTX比对NCBI Nr,Swiss-Prot,KOG和KEGG数据库对unigenes进行功能与代谢通路注释。利用MISA软件对所有unigenes进行SSR搜索,并利用Primer Premier 5软件设计SSR特异性引物,通过PCR对不同来源的球囊菌SSR位点进行扩增。【结果】本研究共获得146 135 308条高质量reads,de novo组装得到42 609个unigenes。BLASTX比对结果显示,29 316个unigenes在上述公共数据库中具有功能和代谢通路注释。注释到法夫酵母Xanthophyllomyces dendrorhous上的unigenes最多,达6 050个。KEGG注释结果显示,unigenes可注释到117个代谢通路,其中富集在核糖体(ribosome)上的unigenes数量最多(529)。所有unigenes中共预测到7 968个SSRs,通过PCR开发出5个球囊菌SSR分子标记。【结论】本研究成功组装球囊菌的参考转录组,并进行了功能与代谢通路注释,可为在分子水平深入研究球囊菌提供重要的参考信息。基于该转录组信息开发的5个SSR分子标记可推动菌株鉴定、基因图谱构建及基因定位等研究。     

中华蜜蜂细胞色素P450基因及其全长转录本的鉴定及分析

【目的】利用纳米孔(nanopore)测序技术鉴定中华蜜蜂Apis cerana cerana工蜂幼虫肠道中细胞色素P450(cytochrome P450, CYP450)基因及其全长转录本,为后续功能研究提供参考信息和基础。【方法】通过Nanopore PromethION平台对中华蜜蜂工蜂4-6日龄幼虫肠道进行转录组测序。利用Guppy软件对原始读段(raw reads)进行质控以得到有效读段(clean reads)。通过识别两端引物鉴定全长转录本序列。使用BLAST工具将上述全长转录本的序列比对到Nr和GO数据库以鉴定CYP450基因及其全长转录本。采用Astalavista软件鉴定基因的可变剪接(alternative splicing, AS)事件。通过RT PCR验证不同类型AS事件的可靠性。【结果】在中华蜜蜂工蜂4-6日龄幼虫肠道中分别测得7 338 627, 7 003 419和7 434 233条原始读段,经质控得到的有效读段数分别为7 289 494, 6 959 880和7 387 756条。鉴定到的非冗余全长转录本总数为48 200条。共鉴定到47个CYP450基因和265条CYP450基因全长转录本。共鉴定到CYP450基因的90次AS事件,包括36次外显子跳跃事件、20次可变5′端剪接位点事件、17次内含子保留事件、9次可变3′端剪接位点事件及8次外显子互斥事件。RT PCR结果证实随机选取的3种AS事件类型真实可靠。【结论】鉴定了中华蜜蜂的CYP450基因及其全长转录本,补充了东方蜜蜂参考基因组的相关注释,并揭示中华蜜蜂CYP450基因可通过多种AS类型产生丰富的剪接体。     

意大利蜜蜂幼虫肠道内球囊菌及其纯培养的高表达基因差异分析

【背景】球囊菌是一种典型的蜜蜂真菌性病原,特异性地侵染蜜蜂幼虫。目前,有关球囊菌在侵染过程中的基因表达规律的信息极为有限。【目的】通过深入分析胁迫意大利蜜蜂(意蜂)幼虫肠道的球囊菌及其纯培养的高表达基因(HEGs)差异,探索球囊菌在胁迫意蜂幼虫肠道后期与胁迫前的基因表达规律。【方法】利用RNA-Seq技术对球囊菌胁迫的意蜂6日龄幼虫肠道(Aam T)及球囊菌纯培养(AaCK)进行深度测序,根据FPKM值筛选得到球囊菌的HEGs,进而通过GO(Gene ontology)及KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析、Venn分析对上述HEGs进行功能预测和生物学意义挖掘。【结果】AaCK与Aam T的转录组测序共得到105 447 578条原始读段(Raw reads),经过滤得到88 466 344条有效读段(Clean reads),两端平均Q20为97.50%,平均Q30为93.81%。GO富集分析结果显示,AaCK的HEGs富集于26个GO terms,基因富集数最多的是细胞(22 Unigenes),其次是细胞组件(22 Unigenes)和代谢过程(21 Unigenes);Aam T的HEGs富集于22个GO terms,基因富集数最多的是催化活性(23 Unigenes),其次是细胞进程(18 Unigenes)和代谢过程(18 Unigenes)。KEGG代谢通路(Pathway)富集分析显示,AaCK的HEGs富集在109个Pathways上,基因富集数最多的是核糖体(179 Unigenes),其次是氨基酸生物合成(70Unigenes)和碳代谢(62 Unigenes);Aam T的HEGs富集在114个Pathways上,基因富集数量最多的是核糖体(178 Unigenes),其次是碳代谢(116 Unigenes)和氧化磷酸化(112 Unigenes)。Venn分析结果显示,AaCK与Aam T共有的HEGs有260个,二者特有的HEGs分别为2 161个和4 445个。【结论】提供了胁迫意蜂6日龄幼虫肠道的球囊菌及其纯培养的HEGs表达谱,揭示了球囊菌在胁迫前和胁迫后期的基因表达规律,也为阐明球囊菌致病的分子机理提供了有益的信息和线索。     

意大利蜜蜂丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因和全长转录本鉴定及验证

【目的】利用前期获得的高质量纳米孔长读段测序数据对意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因和全长转录本进行鉴定和分析,为深入开展功能研究提供参考信息和基础。【方法】基于前期获得的高质量意大利蜜蜂纳米孔长读段测序数据,通过Blast工具将意大利蜜蜂全长转录本比对Nr数据库筛选出丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因和全长转录本;利用gffcompare软件将筛选出的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶全长转录本与西方蜜蜂A.mellifera参考基因组(Amel＿HAv3.1)上注释的转录本进行比较,以鉴定未注释的新基因和新转录本;使用Astalavista软件鉴定丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因的可变剪接(alternative splicing, AS)事件类型,采用IGV浏览器对剪接体的结构进行可视化,通过RT-PCR验证随机选取的6次AS事件的真实性。【结果】共鉴定到意大利蜜蜂丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶71个基因和335条全长转录本,发掘出未注释的1个新基因和97条新转录本;共对14个已注释基因进行了结构优化,分别延伸了6个基因的5′端和8个基因的3′端。共鉴定到意大利...     

胁迫意大利蜜蜂幼虫肠道的球囊菌的转录组分析

【目的】本研究旨在通过趋势分析对胁迫意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica(简称意蜂)幼虫肠道的球囊菌Ascosphaera apis的差异表达基因(DEGs)进行转录组分析。【方法】将纯化的球囊菌孢子配制为1×107孢子/m L的饲料饲喂意蜂3日龄幼虫,利用Illumina Hi Seq 2500平台对球囊菌胁迫的意蜂幼虫肠道c DNA进行测序,将过滤得到的有效读段(clean reads)映射(mapping)到核糖体数据库及意蜂参考基因组,最后将未映射上的reads映射到本课题组组装并注释的球囊菌参考转录组。利用STEM软件对DEGs进行趋势分析。利用WEGO软件对显著表达模式中的DEGs进行GO富集分析。利用Blastall对显著表达模式中的DEGs进行KEGG代谢通路富集分析。最后,通过对随机选取的6个DEGs进行RT-q PCR分析,对RNA-seq数据进行验证。【结果】球囊菌胁迫意蜂幼虫肠道样品的Illumina测序共得到球囊菌的25 454 076条原始读段(raw reads),经过滤得到24 909 820条clean reads,Q30均在93.46%以上。趋势分析结果显示,19 893个DEGs聚类为8个表达模式,其中有12 151个DEGs聚类为3个表现为显著上调趋势的表达模式。GO富集分析结果显示,表现上调趋势的DEGs富集在40个GO term,富集基因数最多的为细胞进程(cellular process)(2 601 unigenes),其次为代谢进程(metabolic process)(2 553 unigenes)和细胞(cell)(2 522unigenes)。KEGG代谢通路富集分析结果显示,上调趋势中的DEGs富集在119个代谢通路上,其中富集基因数最多的是核糖体(ribosome)(213 unigenes),其次为氨基酸生物合成(biosynthesis of amino acids)(154 unigenes)和内质网蛋白加工(protein processing in endoplasmic reticulum)(130unigenes)。共有48个DEGs富集在MAPK信号通路上,聚类分析结果显示,这些DEGs随着胁迫时间的延长表达水平逐渐增强。RT-q PCR结果显示,6个DEGs的表达水平变化趋势与RNA-seq数据一致,证明了本研究中的转录组数据真实可靠。【结论】本研究为在分子水平揭示球囊菌的致病机理提供了重要信息,也为阐释球囊菌胁迫意蜂幼虫过程中的病原-宿主互作机制奠定了基础。     

球囊菌胁迫中华蜜蜂幼虫肠道过程中病原的转录组学研究

【目的】本研究利用RNA-seq技术对球囊菌胁迫的中华蜜蜂(中蜂)幼虫肠道进行深度测序,经趋势分析得到差异表达基因(DEGs)的显著表达模式,进而对胁迫过程中的球囊菌进行转录组学分析。【方法】利用Illumina HiSeq 2500平台对球囊菌胁迫的中蜂幼虫肠道进行深度测序,并利用相关软件进行了深入分析。最后,通过RT-qPCR对RNA-seq数据进行了验证。【结果】本研究共得到球囊菌的41133932条高质量clean reads。22865个DEGs共聚类为8个基因表达模式,其中,16769个DEGs聚类为2个显著上调趋势与2个显著下调趋势。GO富集分析结果显示,显著上调与显著下调趋势中的DEGs分别富集于40与37个GO term,基因富集数最多的为细胞进程(2486 unigenes)。KEGG代谢通路(pathway)富集分析结果显示,显著上调与显著下调趋势中的DEGs分别富集于119和112个pathway,基因富集数最多的分别是氨基酸生物合成(127 unigenes)与核糖体(98 unigenes)。进一步分析表明球囊菌在胁迫中蜂幼虫肠道的过程中通过提高物质合成促进其增殖,而宿主通过抑制球囊菌的蛋白合成抵御病原入侵。富集在MAPK信号通路的11个DEGs的表达水平随着胁迫时间的延长而逐渐下降,推测中蜂幼虫通过抑制该通路而阻遏球囊菌增殖。【结论】本研究不仅为揭示白垩病过程中的球囊菌-中蜂幼虫互作提供了重要信息,也为阐明不同抗性蜂种的球囊菌抗性差异奠定了基础。     

结合三代测序与二代测序技术揭示蜜蜂球囊菌孢子转录组的复杂性

【目的】蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis)是一种专性侵染蜜蜂幼虫的致死性真菌病原。本研究旨在利用PacBio单分子实时(singlemoleculereal-time,SMRT)测序技术对蜜蜂球囊菌孢子(AaS)中基因的可变剪切(alternative splicing,AS)和可变多聚腺苷酸化(alternative polyadenylation,APA)以及长链非编码RNA (long non-coding RNA,lncRNA)进行鉴定和分析,进而揭示蜜蜂球囊菌孢子中转录组的复杂性。【方法】采用Suppa软件对蜜蜂球囊菌孢子中基因的AS事件进行鉴定。通过RT-PCR对不同类型的AS事件进行验证。采用TAPIS pipeline对蜜蜂球囊菌孢子基因的APA位点进行鉴定。利用MEME软件分析孢子全长转录本的poly(A)剪接位点上游50bp的序列特征并鉴定motif。联用CPC和CNCI软件和比对Swiss-prot数据库的方法预测lncRNA,取三者的交集作为高可信度的lncRNA集合。进一步比较lncRNA和mRNA的转录本长度,外显子数量与长度,内含子长度,GC含...     

利用全长转录本优化柞蚕基因组注释(英文)

【目的】优化柞蚕Antheraea pernyi基因组注释,更好地扩展其在比较基因组学及品种改良研究中的应用。【方法】对柞蚕进行全长转录组测序分析;经全长转录本与参考基因组比对,鉴定新基因及新转录本,并对这些新基因和新转录本进行功能注释及长链非编码RNAs (lncRNAs)预测。利用大量的蛋白质编码转录本和lncRNAs对柞蚕基因组中基因结构进行修订。最后创建矫正后的柞蚕基因组基因注释。【结果】新发现1 997个蛋白编码基因和3 399个lncRNA基因,分别由2 402个和3 574个全长转录本数据支持。发现柞蚕基因组含25 021个基因,其中19 825个基因是蛋白编码基因,包括7个保幼激素酸甲基转移酶基因。【结论】本研究促进了对柞蚕基因组基因注释信息的认识,为柞蚕及相关物种功能基因组及比较基因组学研究提供了很有用的数据资源。     

球囊菌侵染对意大利蜜蜂幼虫肠道免疫与解毒相关基因表达及蛋白质、脂质和糖类含量的影响

【目的】球囊菌Ascosphaera apis是一种真菌性病原体,可以侵染意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica幼虫,导致蜂群患白垩病。本研究通过球囊菌侵染意大利蜜蜂幼虫,探究对意大利蜜蜂幼虫肠道免疫解毒相关基因表达及蛋白质、脂质和糖类含量的影响,分析球囊菌侵染胁迫下意大利蜜蜂免疫应答反应与营养物质的关系。【方法】实验室饲养意大利蜜蜂幼虫,处理组每头3日龄幼虫接种2×10⁶孢子/mL球囊菌,对照组饲喂正常食物;收集6日龄幼虫肠道样品。通过qRT-PCR测定收集的肠道样品中免疫、解毒、发育相关基因和病原基因的表达,并利用生化方法测定肠道样品中蛋白质、脂质、葡萄糖和糖原含量。【结果】球囊菌侵染意大利蜜蜂后,幼虫肠道免疫相关基因LOC406144, Apid1, Def1, Def2, LOC406142, PGRP-SA, Pgrp-s2, PGRP-S3, PGRP-lc, GNBP-1, GNBP3, PPOact, LOC552247, domeless, KAT2A和bsk显著上调表达,cactus显著下调表达;解毒相关基因Cat, GSTS3, Cyp4g11, LOC725294, Ampka-r1, LOC411223, LOC409791, AmNOS和Sod2显著上调表达,CYP6AS14, CPR14, CYP306A1和LOC100576555显著下调表达;发育相关基因usp显著上调表达,VGMC, HEX70b和Vg显著下调表达;病原基因BQCV capsid protein和Ascosphaera apis 28S rRNA表达量显著上升;蛋白质与脂质含量显著下降,葡萄糖与糖原含量显著上升。【结论】球囊菌侵染意大利蜜蜂幼虫后影响其幼虫肠道中免疫、解毒、发育相关基因和病原基因的表达,影响意大利蜜蜂的免疫应答及能量应激反应,加速蛋白质、脂质的流失及葡萄糖和糖原能量储备,影响机体正常的生理活动。     

意大利蜜蜂幼虫肠道在球囊菌胁迫后期的差异表达微小RNA及其靶基因分析

【目的】蜜蜂球囊菌Ascosphaera apis(简称球囊菌)是一种特异性侵染蜜蜂幼虫肠道的致死性真菌病原。微小RNA(microRNA,mi RNA)是一种在转录后水平对m RNA进行负调控的关键调控因子。本研究旨在对意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica(简称意蜂)幼虫肠道在球囊菌胁迫后期的差异表达mi RNAs(DEmiRNAs)及其靶基因进行深入分析,为揭示DEmiRNAs在胁迫应答中的作用提供重要信息。【方法】利用small RNA-seq(s RNA-seq)技术对正常及球囊菌侵染的意蜂6日龄幼虫肠道(分别表示为Am CK和Am T)进行测序,通过相关生物信息学软件对DEmiRNAs进行预测和分析。利用TargetFinder软件预测DEmiRNAs的靶基因,然后利用Blast软件对靶基因进行GO和KEGG数据库的功能注释。通过Cytoscape软件构建DEmiRNAs与其靶m RNAs的调控网络。通过茎环实时荧光定量PCR(stem-loop RT-qPCR)验证测序数据的可靠性。【结果】Am CK和Am T的测序分别得到9 230 496和10 823 667条有效序列标签; Am CK vs Am T比较组中包含15个上调和6个下调mi RNAs,分别结合3 503和3 252个靶基因,它们可分别注释到40和39个GO terms以及104和99条代谢通路;进一步分析发现调控网络中的17个DEmiRNAs靶向结合116个与丝氨酸蛋白酶相关的m RNAs,14个DEmiRNAs靶向结合54个与泛素介导的蛋白水解相关的m RNAs。Stem-loop RT-qPCR验证结果显示随机选择的4个DEmiRNAs (mi R-251-x,mi R-9277-y,mi R-1672-x和mi R-4968-y)的表达量变化趋势与测序结果一致,表明测序数据真实可信。【结论】本研究率先对意蜂幼虫肠道在球囊菌胁迫后期的DEmiRNAs及其靶基因进行预测与分析,提供了mi RNAs的表达谱和差异表达信息。ame-miR-927b,mi R-429-y和mi R-8440-y等DEmiRNAs可能参与对丝氨酸蛋白酶的调控和对泛素介导的蛋白水解的调控,DEmiRNAs与靶基因之间存在复杂的调控网络关系。DEmiRNAs可参与到意蜂幼虫肠道与球囊菌间的互作。     

棉铃虫剂量补偿相关基因Hamsl1的鉴定与功能分析

【目的】棉铃虫Helicoverpa armigera的剂量补偿(dosage compensation, DC)分子机制尚不清楚。本研究旨在通过克隆棉铃虫雄性特异性致死(male specific lethal, msl) 基因Hamsl1,利用RNA干扰技术明确其是否参与调控棉铃虫剂量补偿。【方法】利用RT-PCR同源克隆棉铃虫Hamsl1基因全长cDNA; 利用qPCR技术研究Hamsl1基因在棉铃虫不同发育时期的表达谱;通过显微注射Hamsl1 siRNA到棉铃虫3龄幼虫中对Hamsl1基因进行RNA干扰后,利用qPCR技术检测15个Z染色体基因的表达情况,分析Hamsl1是否调控Z染色体基因剂量。【结果】成功克隆了棉铃虫Hamsl1基因的cDNA序列,鉴定出Hamsl1基因mRNA存在2种剪接体,分别命名为Hamsl1a(GenBank登录号: MK564008)和Hamsl1b(GenBank登录号: MK564009)。功能域分析发现HaMSL1含有典型的PEHE和coiled-coil功能域,具有MSL1蛋白的特征。qPCR分析表明,Hamsl1基因位于棉铃虫Z染色体上;棉铃虫Hamsl1a与Hamsl1b基因表达均具有发育时期特异性,在成虫期表达量最高,且雌雄化蛹后基因表达量差异显著,具有性别特异性。通过同源比对和qPCR分析,在DNA水平鉴定了15个Z染色体候选基因。显微注射Hamsl1 siRNA于3龄幼虫体内72 h,干扰效率为36.01%~64.27%,并未发生雄性致死现象;与对照组相比,Hamsl1 RNAi处理组中棉铃虫15个Z染色体基因在雄性个体中整体呈现表达量上调趋势,而在雌性个体中平均表达水平差异不显著。【结论】本研究初步探明Hamsl1基因位于棉铃虫Z染色体上,且该基因可能通过抑制雄性棉铃虫Z染色体基因表达,调控棉铃虫Z染色体剂量补偿。本研究为深入研究棉铃虫剂量补偿分子机制和绿色防控棉铃虫提供了理论基础。