ame-miR-79负调控意大利蜜蜂工蜂幼虫肠道中靶基因CYP450和FG的表达

【目的】本研究旨在通过饲喂ame-miR-79的模拟物(mimic)和抑制物(inhibitor)对意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica工蜂幼虫肠道内的ame-miR-79分别进行过表达和敲减,探究ame-miR-79对幼虫肠道内靶基因表达的调控作用。【方法】通过分子克隆与Sanger测序验证意大利蜜蜂工蜂幼虫肠道内ame-miR-79的序列真实性。通过饲喂mimic-miR-79和inhibitor-miR-79对意大利蜜蜂工蜂4-6日龄幼虫肠道内的ame-miR-79分别进行过表达和敲减。采用相关生物信息学软件进行ame-miR-79的靶基因预测与分析。通过RT-qPCR检测ame-miR-79的过表达和敲减效果及过表达和敲减ame-miR-79后靶基因的相对表达量。【结果】ame-miR-79在意大利蜜蜂工蜂幼虫肠道内真实存在。与无义模拟物(nonsense mimic, mimic-NC)组相比,mimic-miR-79组的4-6日龄幼虫肠道内ame-miR-79的表达量皆极显著上调;与无义抑制物(nonsense inhibitor, inhibitor-NC)组相比,inhibitor-miR-79组的4和5日龄幼虫肠道内ame-miR-79的表达量显著下调,6日龄幼虫肠道内ame-miR-79的表达量极显著下调。ame-miR-79共靶向303个基因,涉及27个GO条目和179条KEGG通路。相较于mimic-NC组,靶基因细胞色素P450基因CYP450在mimic-miR-79组的4和5日龄幼虫肠道内均极显著下调表达,而在6日龄幼虫肠道内上调表达;靶基因fringe糖基化转移酶(fringe glycosyltransferase, FG)基因在4日龄幼虫肠道内下调表达,在5日龄幼虫肠道内显著下调表达,而在6日龄幼虫肠道内上调表达。相较于inhibitor-NC组,CYP450在inhibitor-miR-79组的4日龄幼虫肠道内极显著上调表达,在6日龄幼虫肠道内上调表达,而在5日龄幼虫肠道内下调表达;FG的表达水平在4日龄幼虫肠道内显著上调,在5和6日龄幼虫肠道内极显著上调。【结论】ame-miR-79在意大利蜜蜂工蜂幼虫肠道内真实存在;通过饲喂模拟物和抑制物能分别实现意大利蜜蜂工蜂幼虫肠道内ame-miR-79的有效过表达和敲减;ame-miR-79负调控意大利蜜蜂工蜂幼虫肠道内CYP450和FG的表达。     

东方蜜蜂微孢子虫侵染过程中nce-miR-34537和靶基因PIP5KI的表达谱

【目的】本研究旨在对前期鉴定到的nce-miR-34537进行表达和序列验证,预测nce-miR-34537的靶基因并明确其分子特性,进而检测nce-miR-34537及其靶基因在东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)侵染意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica)工蜂过程的表达谱,为进一步探究nce-miR-34537调控东方蜜蜂微孢子虫侵染的功能和作用机制提供基础。【方法】通过Stem-loop-RT-PCR和Sanger测序验证nce-miR-34537的表达和序列。通过生物信息学软件预测nce-miR-34537的靶基因PIP5KI(I型磷脂酰肌醇4-磷酸-5-激酶基因)的理化性质等分子特性和保守基序,并构建基于氨基酸序列的系统进化树。采用RT-qPCR检测nce-miR-34537及其靶基因的表达谱。【结果】nce-miR-34537在东方蜜蜂微孢子虫孢子中真实存在和表达。nce-miR-34537共靶向PIP5KI等151个基因。PIP5KI蛋白的分子式为C₈₈₂H_{1 364}N₂₂₆     

过表达和敲减ace-miR-3720对中华蜜蜂工蜂幼虫肠道的靶基因表达和重量的影响

【目的】本研究旨在明确ace-miR-3720在中华蜜蜂Apis cerana cerana工蜂幼虫肠道发育中的功能,并为进一步探究ace-miR-3720调控肠道发育的分子机理提供理论和实验依据。【方法】根据ace-miR-3720的核苷酸序列设计合成相应的模拟物mimic-miR-3720和抑制物inhibitor-miR-3720,通过饲喂中华蜜蜂工蜂幼虫对ace-miR-3720分别进行过表达和敲减。采用RT-qPCR检测过表达和敲减ace-miR-3720后4-6日龄幼虫肠道内ace-miR-3720及其靶基因CKⅠ, MAPK1和βGBP1的相对表达量;使用分析天平称重过表达和敲减ace-miR-3720后的幼虫肠道重量。【结果】相较于无义模拟物(nonsense mimic, mimic-NC)组,mimic-miR-3720组中ace-miR-3720表达量在中华蜜蜂4和5日龄幼虫肠道中均极显著上调,在6日龄幼虫肠道中显著上调;相较于无义抑制物(nonsense inhibitor, inhibitor-NC)组,inhibitor-miR-3720组中ace-miR-3720表达量在4日龄幼虫肠道中极显著下调,在5和6日龄幼虫肠道中显著下调。ace-miR-3720与基因CKⅠ, MAPK1和βGBP1之间存在潜在靶向关系。与mimic-NC组相比,mimic-miR-3720组中CKⅠ表达量在4和5日龄幼虫肠道中皆极显著下调,在6日龄幼虫肠道中显著下调;MAPK1表达量在4日龄幼虫肠道中显著下调,在5和6日龄幼虫肠道中均极显著下调;βGBP1表达量在4日龄幼虫肠道中显著下调,在5和6日龄幼虫肠道中均极显著下调;此外,4和5日龄幼虫肠道重量均极显著降低,6日龄幼虫肠道重量显著降低。与inhibitor -NC组相比,inhibitor-miR-3720组中CKⅠ表达量在4-6日龄幼虫肠道中皆极显著上调;MAPK1表达量在4日龄幼虫肠道中显著上调,在5和6日龄幼虫肠道中极显著上调;βGBP1表达量在4和6日龄幼虫肠道中显著上调,在5日龄幼虫肠道中极显著上调;此外,4和6日龄幼虫肠道重量显著升高,5日龄幼虫肠道重量极显著升高。【结论】ace-miR-3720在中华蜜蜂工蜂幼虫肠道内真实存在;通过饲喂模拟物和抑制物可对中华蜜蜂工蜂幼虫肠道内分别实现miRNA的有效过表达和敲减;ace-miR-3720可能通过调控CKⅠ, MAPK1和βGBP1的表达影响中华蜜蜂工蜂幼虫肠道重量并参与幼虫肠道发育。     

蜜蜂球囊菌菌丝和孢子中毒力因子相关全长转录本的鉴定及分析

[目的]蜜蜂球囊菌Ascosphaera apis是一种专性侵染蜜蜂幼虫而导致白垩病的致死性真菌病原.基于前期已获得的高质量纳米孔(Nanopore)长读段测序数据,对蜜蜂球囊菌菌丝(AaM)和孢子(AaS)中的毒力因子相关全长转录本进行鉴定和分析,为毒力因子相关剪接异构体的功能研究提供参考信息和基础.[方法]利用BLAST工具,将AaM和AaS中的所有全长转录本比对Nr数据库,以鉴定蜜蜂球囊菌的毒力因子(几丁质酶、脂肪酶、水解酶和蛋白酶)相关的全长转录本.使用minimap2软件,将AaM和AaS中的全长转录本序列与蜜蜂球囊菌参考基因组注释的已知转录本序列进行比对,将比对到参考基因组的全长转录本进行归一化处理,再通过每百万计数法(Counts per million,CPM)计算毒力因子相关全长转录本的表达量.利用百迈克云平台的相关工具绘制转录本的表达量聚类热图.通过IGV浏览器对部分毒力因子相关全长转录本结构进行可视化.[结果]在AaM鉴定到毒力因子相关的367个基因及407个全长转录本,包括12条几丁质酶相关全长转录本,48条脂肪酶相关全长转录本,289条水解酶相关全长转录本,58条蛋白酶相关全长转录本.在AaS鉴定到毒力因子相关367个基因及400个全长转录本,包括14条几丁质酶相关全长转录本,63条脂肪酶相关全长转录本,267条水解酶相关全长转录本,56条蛋白酶相关全长转录本.另外,AaM和AaS特有的毒力因子(几丁质酶、脂肪酶)相关全长转录本分别有0条和17条,共有的毒力因子相关全长转录本有60条.进一步分析发现,蜜蜂球囊菌的部分毒力因子基因可通过可变剪接形成多条剪接异构体.[结论]共鉴定到蜜蜂球囊菌毒力因子(几丁质酶、脂肪酶、水解酶和蛋白酶)相关的367个基因和486条全长转录本;相比于蜜蜂球囊菌参考基因组注释的转录本,绝大多数毒力因子基因对应的全长转录本数量更多且结构更为复杂.研究结果丰富了蜜蜂球囊菌毒力因子相关基因和转录本的注释信息,为毒力因子相关剪接异构体的功能研究提供了基础,也为白垩病防控提供了潜在靶点.     

东方蜜蜂微孢子虫孢子中微小RNA的鉴定与分析

【目的】丰富东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae的微小RNA(microRNA, miRNA)信息,并为深入探究miRNA在病原孢子和病原侵染中的功能提供理论和实验依据。【方法】基于已获得的small RNA-seq数据,利用生物信息学软件对东方蜜蜂微孢子虫的纯净孢子中的miRNA进行鉴定和分析。采用茎环反转录PCR(stem-loop RT-PCR)检测已鉴定的miRNA的表达;通过分子克隆与Sanger测序验证miRNA的序列。使用TargetFinder软件预测这些miRNA的靶基因,并对靶基因进行数据库注释。根据miRNA与靶基因的靶向结合关系构建调控网络,再利用Cytoscape软件进行可视化。【结果】在东方蜜蜂微孢子虫孢子中共鉴定到10个miRNA;这些miRNA的长度分布介于21~25 nt,首位碱基表现出U偏向性,每一位碱基的偏向性差异明显。Stem-loop RT-PCR检测结果表明这10个miRNA均真实表达;Sanger测序结果证实了随机选取的其中2个miRNA的序列真实性。共预测出249个靶基因,其中分别有249, 118, 136和3个靶基因可注释到Nr,Swiss-Prot, KOG和eggNOG数据库。此外,分别有134和71个靶基因可分别注释到GO数据库的30个功能条目和KEGG数据库的54条通路。【结论】本研究揭示了东方蜜蜂微孢子虫孢子中miRNA的存在和表达;这些miRNA通过调控潜在靶基因的表达参与孢子的生命活动。     

意大利蜜蜂工蜂幼虫nkd基因的生物信息学分析及功能研究

【目的】意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica,简称意蜂)是西方蜜蜂(Apis mellifera)的亚种之一。蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis)侵染意蜂幼虫导致白垩病。本研究对西方蜜蜂裸表皮蛋白(naked cuticle, Nkd)进行保守基序预测和系统进化分析,并通过RNAi明确nkd基因对意蜂工蜂幼虫体重及宿主响应蜜蜂球囊菌胁迫的免疫应答的影响,以期丰富西方蜜蜂基因nkd的信息,并揭示意蜂幼虫nkd的功能。【方法】通过MEME软件预测西方蜜蜂和其他9个物种Nkd蛋白的保守基序。采用MEGA X软件对西方蜜蜂及其他9个物种的Nkd蛋白进行系统进化分析。通过饲喂dsRNA对意蜂幼虫肠道内的nkd进行RNAi。使用电子天平对幼虫进行称重。利用RT-qPCR检测nkd基因的干扰效率及免疫基因的相对表达量。【结果】西方蜜蜂与东方蜜蜂、柑橘凤蝶、家蚕和金凤蝶的Nkd蛋白均含有3个保守基序(motif 1、motif 2 和motif 3),说明上述5个昆虫物种的Nkd具有较高的保守性。西方蜜蜂与东方蜜蜂的Nkd蛋白聚为一支,说明二者的亲缘关系近。与dsRNA-egfp组相比,dsRNA-nkd组5日龄和6日龄幼虫肠道内nkd的表达量均极显著下调(P<0.001),干扰效率分别为49.60%和56.40%。另外,dsRNA-nkd组幼虫体重较dsRNA-egfp组显著下降,说明nkd显著影响幼虫体重。RT-qPCR结果显示,4日龄幼虫肠道内abaecin、apidaecin、birc5、defensin-1和PGRP-S2均被激活表达;5日龄幼虫肠道内abaecin、apidaecin、birc5和defensin-1均被激活表达,PGRP-S2的表达受到抑制;6日龄幼虫肠道内abaecin被激活表达,而apidaecin、birc5、defensin-1和PGRP-S2的表达均受到抑制,说明上述5个免疫基因在宿主响应胁迫的过程中呈不同的表达趋势,均参与宿主的免疫应答,nkd与abaecin和apidaecin的表达存在负向调控关系。【结论】西方蜜蜂的Nkd蛋白含有3个保守基序(motif 1、motif 2和motif 3),西方蜜蜂与东方蜜蜂的Nkd蛋白亲缘关系最近,通过饲喂dsRNA能有效干扰意蜂工蜂幼虫肠道内nkd表达,nkd影响意蜂工蜂幼虫体重及宿主对蜜蜂球囊菌胁迫的免疫应答。     

三种微小RNA在意大利蜜蜂工蜂蛹期发育过程中的表达谱及潜在功能

[目的]意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica是生产性能优良的西方蜜蜂Apis mellifera亚种.本研究旨在利用分子生物学手段揭示3种微小RNA(microRNA,miRNA) ame-miR-13b,ame-miR-100和ame-miR-bantam调控蛹期变态发育的分子机理.[方法]通过...     

西方蜜蜂几丁质合成酶基因的生物信息学分析及功能研究

【目的】本研究旨在明确西方蜜蜂Apis mellifera几丁质合成酶(chitin synthase, CHS)基因的分子特性，并揭示CHS在西方蜜蜂工蜂幼虫响应蜜蜂球囊菌Ascosphaera apis胁迫的免疫应答中的功能。【方法】利用相关生物信息学软件预测和分析西方蜜蜂CHS蛋白的分子特性、保守基序和结构域。使用MEGA X软件对西方蜜蜂和其他昆虫CHSs的氨基酸序列进行系统进化分析。采用体外转录法合成CHS和egfp的dsRNA,饲喂蜜蜂球囊菌胁迫的西方蜜蜂工蜂3日龄幼虫以进行RNAi,并利用RT-qPCR检测西方蜜蜂工蜂5日龄幼虫肠道中CHS及宿主响应蜜蜂球囊菌侵染的免疫相关基因abaecin,apidaecin,birc5,defensin-1和PGRP-S2的表达量。【结果】西方蜜蜂CHS蛋白含有1 572个氨基酸，属于20种氨基酸，其中正电荷氨基酸与负电荷氨基酸分别为177和169个，分子量约为178.77 kD,等电点为6.65;含纤维素合酶CESA3催化结构域。在西方蜜蜂和东方蜜蜂A.cerana等共13种昆虫的CHSs中均鉴定到3个Motif (Motif 1,...