基于Illumina HiSeq测序技术研究吡虫啉对意大利蜜蜂雄蜂的影响

[目的]雄蜂对蜂群繁衍有着非常重要的作用.本研究旨在探究吡虫啉对意大利蜜蜂Apis mellifera Ligustica雄蜂生长发育和基因表达产生的影响.[方法]以意大利蜜蜂雄蜂为研究对象,分别以0.00001、0.0001和0.001 μg/μL浓度的吡虫啉对雄蜂幼虫进行连续饲喂处理.每天观察并记录幼虫的发育形态及死亡率,在雄蜂幼虫后期(移虫后6d)测量幼虫体重.利用Illumina HiSeq测序技术对经吡虫啉处理的雄蜂进行转录组测序,进而对差异表达基因进行深入分析.[结果]取食吡虫啉后的雄蜂幼虫,体重低于正常雄蜂,当浓度高于0.0001μg/μL时差异显著;雄蜂幼虫取食吡虫啉后出现死亡现象,且死亡率随吡虫啉浓度的升高而增大;差异表达基因分析结果上调与下调基因数量分别为390个和130个.GO富集分析结果上调基因共分布于55个GO条目,富集基因数量最多的是细胞进程、细胞、细胞组件、细胞膜、细胞膜组件、结合,下调基因共分布于48个GO条目,富集基因数量最多的是细胞进程、细胞、细胞组件.富集在有关生殖功能的差异表达基因中,上调基因数量为21个,下调基因数量为5个.KEGG代谢通路富集分析结果上调基因富集在159个通路上,其中富集基因数最多的是蛋白质消化吸收和神经活性配体-受体相互作用通路.下调基因富集在71个通路上,其中富集基因数最多的是溶酶体、胰液分泌、神经活性配体-受体相互作用通路.[结论]吡虫啉能抑制意大利蜜蜂雄蜂的生长发育,甚至造成幼虫死亡,同时,可以影响雄蜂的神经系统、代谢系统和生殖系统等.本研究结果为蜜蜂资源保护提供理论依据.     

应用等温环介导扩增方法检测蜜蜂残翅病毒的研究

本文的目的在于建立用于临床检测残翅病病毒(Deformed wing virus,DWV)的等温环介导扩增技术(Loopmediated isothermal amplification,LAMP),为该疾病的预防和控制提供理论依据。在DWV基因保守序列设计4条引物,探究LAMP扩增的最优条件,并与常规的PCR(polymerase chain reaction)检测方法进行比较。建立的LAMP方法检测下限为0.89 pg,灵敏度比PCR高100倍而且特异性好。临床检测显示建立的LAMP方法可行、准确、方便、灵敏。针对DWV的LAMP建立的检测方法为养蜂生产第一线检测和预防DWV提供了技术支持,有一定的应用价值。     

用于蜜蜂和熊蜂肠道微生物分类的细菌16S rRNA数据库优化

蜜蜂和熊蜂是重要的传粉昆虫, 对农业生产及生态平衡的维持具有重要作用。近年来, 研究发现蜜蜂及熊蜂肠道内含有大量微生物, 其组成简单、特异。正常的肠道微生物群落对蜜蜂的生长、激素调节、致病菌抵抗等具有重要作用。随着高通量测序的发展, 研究者们也可快速获得传粉蜂肠道微生物组成, 这给生物多样性和物种保护及蜂类健康等的研究带来了便捷。但是由于蜜蜂和熊蜂肠道微生物群落均由特殊菌种组成, 目前的细菌16S rRNA数据库无法对其进行准确的分类, 并且部分东方蜜蜂(Apis cerana)特有的肠道微生物菌种缺乏16S rRNA序列信息。本文从来源于5个不同省份的东方蜜蜂肠道中分离得到在东方蜜蜂中普遍含有的Apibacter菌属纯菌, 获取其全长16S rRNA序列, 并对目前蜜蜂和熊蜂肠道的5个核心菌种的分类进行了综述, 对其分类和命名进行了修正。根据蜜蜂肠道微生物的明确分类, 在目前常用的SILVA细菌分类数据库基础之上对其进行了命名及分类优化, 并加入东方蜜蜂中普遍含有的Apibacter序列, 从而获得了优化数据库Bee Gut Microbiota-Database (BGM-Db)。通过1组东方蜜峰及1组西方蜜蜂(Apis mellifera)的肠道菌群高通量测序结果, 分析不同数据库的表现, 我们发现相比于SILVA和Ribosomal Database Project (RDP), BGM-Db对蜜蜂肠道16S rRNA高通量测序短序列实现了菌种级别的分类, 分辨率更高。     

室内纱笼条件下不同蛋白饲粮对工蜂生理代谢的影响

本文旨在探究不同蛋白饲粮对蜜蜂生长发育代谢的影响进而指导养蜂生产实践,试验选取刚出房的意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica 270头,分为3组,3个重复,每个重复30头工蜂,分别饲喂3种饲粮。对照组饲粮：蜂蜜∶蔗糖粉=1∶3;试验组A饲粮：花粉∶蜂蜜∶蔗糖粉=5∶1∶6;试验组B饲粮：蜂粮∶蜂蜜∶蔗糖粉=5∶1∶6。在纱笼内进行室内喂养,观察记录蜜蜂7 d内的存活情况;采用液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）方法检测试验组A与B饲粮对饲喂5日龄蜜蜂的代谢差异,对数据进行模式识别分析,筛选鉴别差异代谢物。结果表明：饲喂试验组B饲粮的蜜蜂比试验组A蜜蜂存活时间显著增长（P<0.05）;代谢组数据显示试验组A和B明显分离,共鉴定出15个差异代谢物,包括氨基酸、维生素、糖类等,其中11个差异代谢物下调,4个差异代谢物上调;代谢物通路分析差异显著有甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢通路,精氨酸和脯氨酸代谢通路,赖氨酸降解通路、戊糖磷酸通路（P<0.05）。说明在纱笼等特殊环境中,工蜂饲粮不可直接加入花粉,按照蜂粮∶ 蜂蜜∶蔗糖粉=5∶1∶6的比例混合制成的人工饲粮更适合蜜蜂生存。     

基于Illumina HiSeq测序技术研究吡虫啉对意大利蜜蜂雄蜂的影响

[目的]雄蜂对蜂群繁衍有着非常重要的作用.本研究旨在探究吡虫啉对意大利蜜蜂Apis mellifera Ligustica雄蜂生长发育和基因表达产生的影响.[方法]以意大利蜜蜂雄蜂为研究对象,分别以0.00001、0.0001和0.001 μg/μL浓度的吡虫啉对雄蜂幼虫进行连续饲喂处理.每天观察并记录幼虫的发育形态及死亡率,在雄蜂幼虫后期(移虫后6d)测量幼虫体重.利用Illumina HiSeq测序技术对经吡虫啉处理的雄蜂进行转录组测序,进而对差异表达基因进行深入分析.[结果]取食吡虫啉后的雄蜂幼虫,体重低于正常雄蜂,当浓度高于0.0001μg/μL时差异显著;雄蜂幼虫取食吡虫啉后出现死亡现象,且死亡率随吡虫啉浓度的升高而增大;差异表达基因分析结果上调与下调基因数量分别为390个和130个.GO富集分析结果上调基因共分布于55个GO条目,富集基因数量最多的是细胞进程、细胞、细胞组件、细胞膜、细胞膜组件、结合,下调基因共分布于48个GO条目,富集基因数量最多的是细胞进程、细胞、细胞组件.富集在有关生殖功能的差异表达基因中,上调基因数量为21个,下调基因数量为5个.KEGG代谢通路富集分析结果上调基因富集在159个通路上,其中富集基因数最多的是蛋白质消化吸收和神经活性配体-受体相互作用通路.下调基因富集在71个通路上,其中富集基因数最多的是溶酶体、胰液分泌、神经活性配体-受体相互作用通路.[结论]吡虫啉能抑制意大利蜜蜂雄蜂的生长发育,甚至造成幼虫死亡,同时,可以影响雄蜂的神经系统、代谢系统和生殖系统等.本研究结果为蜜蜂资源保护提供理论依据.     

昆虫气味结合蛋白的研究进展

摘要: 昆虫主要依赖其复杂且灵敏的化学感受系统来识别并区分外界环境中的各种化学信号。嗅觉是负责嗅觉信号传导的感官方式,能够引起昆虫觅食、产卵、交配和躲避天敌等对生存和繁殖至关重要的行为反应。在嗅觉感知过程中,气味结合蛋白(odorant binding proteins, OBPs)最先与外界脂溶性化学物质相互作用,并将其转运至化学受体神经元上,激活树突膜表面分布的嗅觉受体(olfactory receptors, ORs),是嗅觉系统正常运行的必需蛋白。近年来,随着高通量测序和分子生物学技术的快速发展,越来越多的昆虫OBPs相继得以鉴定并开展功能研究。昆虫OBPs是一类可溶性的小分子蛋白,一般由6个α-螺旋构成一个稳定、紧密的疏水性结合腔,其构象变化因昆虫种类和配体结构不同而有所差异。OBPs的分布不受限于嗅觉器官,还在口器、足、中肠、腺体等非嗅觉组织中表达,具有嗅觉识别、味觉感受、营养物质转运、信息素合成与释放、组织发育与分化等生理功能。OBPs行使以上功能的共同特性为结合和溶解包括信息素组分、普通气味分子和非挥发性物质等的疏水性小分子物质。昆虫OBPs的稳定性和多功能性暗示其可广泛应用于害虫防治、生物传感器、分析化学、生态学等多个领域。本文对过去20多年来昆虫OBPs的相关研究进行综述,为进一步深入开展OBPs的功能研究提供理论参考。     

欧洲黑蜂和新疆黑蜂越冬期抗氧化酶活性及相关基因表达分析

以欧洲黑蜂和新疆黑蜂为研究对象,比较和分析两个蜂种在越冬条件下抗氧化酶活性和抗氧化能力相关基因表达的变化规律,探究二者在越冬期的抗氧化酶功能及其基因表达特征。本试验测定了蜂群损失率和饲料消耗量等越冬性能指标以及总抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（T-SOD）和过氧化氢酶（CAT）等抗氧化酶的酶活力值,并采用实时荧光定量PCR方法检测SOD、CAT、Grx1、MsrA和Vg基因等抗氧化酶功能基因的表达情况。结果显示,欧洲黑蜂和新疆黑蜂的蜂群损失率和饲料消耗率分别为32.86%、32.91%和23.41%、23.91%。在抗氧化酶活性变化规律方面,两个蜂种的T-AOC酶活力呈逐步升高趋势;T-SOD酶活力呈先下降再升高的趋势,在越冬中期达到最低值;CAT酶活力呈先升高再降低又再升高的趋势;在抗氧化功能相关基因的mRNA表达方面,两个蜂种的SOD基因和CAT基因的表达在越冬中期达到最低值;Grx1基因的表达在越冬后期急剧升高,达到峰值;MsrA基因的表达呈先降低后升高的趋势;Vg基因的表达在越冬的中前期呈逐渐升高趋势。结果表明,在低温逆境条件下,两个蜂种体内的抗氧化酶系统可能发挥了重要的防御作用,存在一定的耐寒适应机制,其中越冬中期可能是酶活性变化和基因表达的发生显著变化的特殊阶段。本试验的研究为揭示蜜蜂体内抵御低温应答机制研究提供新线索,也为深入研究蜜蜂耐寒分子机制和抗寒蜂种的选育提供基础数据。     

ame-miR-14在意大利蜜蜂工蜂幼虫肠道发育过程的调控作用

【目的】本研究旨在揭示ame-miR-14在意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica工蜂幼虫肠道发育过程的调控作用。【方法】通过Stem-loop RT-PCR和Sanger测序分别验证ame-miR-14在意大利蜜蜂工蜂6日龄幼虫肠道中的表达和序列真实性。饲喂ame-miR-14的模拟物(mimic-ame-miR-14)和抑制物(inhibitor-ame-miR-14)及其相应的阴性对照mimic-NC和inhibitor-NC对ame-miR-14分别进行过表达和敲降,利用RT-qPCR检测意大利蜜蜂工蜂4-6日龄幼虫肠道中ame-miR-14的表达量。利用生物信息学软件预测ame-miR-14的靶基因并进行相关分析。利用RT-qPCR检测ame-miR-14的过表达和敲降后其靶基因FoxO和Hedgehog在4-6日龄幼虫肠道中的相对表达量。【结果】ame-miR-14在意大利蜜蜂工蜂6日龄幼虫肠道中真实存在和表达。相较于饲喂mimic-NC,饲喂mimic-ame-miR-14后ame-miR-14表达量在意大利蜜蜂工蜂4-6日龄幼虫肠道中均为显著上调;相...     

中华蜜蜂HSC70-4基因表达特性的研究

组成型热休克蛋白70-4(heat shock protein 70 cognate 4,HSC70-4)是HSP70家族的重要成员,对蛋白质的正确折叠与转运有着重要意义。本研究以中华蜜蜂转录组数据中获得的HSC70-4基因序列为基础,通过对中华蜜蜂不同发育阶段、不同组织以及不同低温胁迫下的HSC70-4 m RNA表达量进行测定,以期为揭示该基因在中华蜜蜂生长发育和耐寒抗冻过程中的生理功能提供理论依据。结果显示,中华蜜蜂HSC70-4基因包含1923 bp的开放阅读框,编码641个氨基酸,蛋白分子量为70.4 k Da。中华蜜蜂HSC70-4氨基酸序列中包含3个HSP70家族的标签序列,其N端含有HSC70家族的GGXP四肽结构标志,C端包含EEVD结构。与膜翅目其它昆虫的氨基酸序列一致性在94%以上,具有较高的保守性。中华蜜蜂HSC70-4在成虫期的表达量显著高于幼虫期和蛹期(P0.01),从幼虫期至10日龄成虫期呈逐渐上升趋势,但在15日龄至30日龄间呈现波动起伏。HSC70-4在中华蜜蜂不同组织中的表达存在显著差异(P0.01),且在胸部高度表达,在足中中度表达,在其余组织中低度表达。中华蜜蜂HSC70-4的表达受低温胁迫的诱导,在低温胁迫2 h时其表达量最低,4 h时表达量最高。本研究结果表明中华蜜蜂HSC70-4在中华蜜蜂的生长发育过程中应对低温胁迫时发挥生理功能。     

基于代谢组方法筛选蜜蜂副伤寒相关差异代谢物的研究

[目的]蜜蜂副伤寒是西方蜜蜂Apis mellifera越冬期的主要易感疾病.本研究旨在探究蜜蜂副伤寒疾病相关的代谢物和代谢通路.[方法]以越冬末期的西方蜜蜂为研究对象,利用基于高效液相质谱联用的非靶向代谢组学方法检测副伤寒患病群和正常越冬群工蜂肠道中代谢物的变化.[结果]蜜蜂副伤寒患病个体和正常蜜蜂个体在正、负离子模式下分别获得626个和518个差异代谢物,在正、负离子模式下最显著差异的10种代谢物中筛选到镰刀菌氧萘满酮、奎尼丁、褪黑素、去氧紫草素等与蜜蜂物质代谢障碍、细胞凋亡和抗氧化应激相关的差异代谢物.此外,差异代谢物显著富集于与氨基酸代谢密切相关的氨酰-tRNA合成、蛋白质消化吸收、谷胱甘肽代谢、矿物质代谢、多种氨基酸代谢等7个代谢通路.[结论]蜜蜂患副伤寒后肠道中代谢物水平发生显著变化,其中氨基酸和蛋白质的代谢异常可能是蜜蜂副伤寒发病的主要原因.