意大利蜜蜂幼虫肠道的miRNAs的生物信息学预测及分析

【目的】蜜蜂肠道是食物消化和营养吸收的主要部位,同时也是抵御病原侵染的重要场所。本研究旨在对意大利蜜蜂Apismelliferaligustica(简称意蜂)幼虫肠道的microRNAs(miRNAs)及其靶基因进行深入分析,进而解析miRNAs在幼虫肠道发育和生长过程中的作用。【方法】利用small RNA-seq(sRNA-seq)技术对意蜂4、5和6日龄幼虫肠道进行测序,通过相关生物信息学软件对意蜂幼虫肠道的miRNAs进行预测及分析。利用TargetFinder软件预测miRNAs的靶基因,然后将靶基因通过BLAST软件进行GO和KEGG数据库的功能注释。利用Cytoscape软件构建miRNAs与其靶向结合的mRNAs的调控网络。【结果】意蜂幼虫肠道样品的测序共获得96 329 456条有效标签序列(Clean tags),预测出560个miRNAs,包括45个novelmiRNAs。上述miRNAs的长度主要分布在17-27nt之间,且不同长度的miRNAs的首位碱基偏向性具有明显差异。表达量聚类分析结果显示,331个miRNAs为4、5和6日龄幼虫肠道所共有且表达量较为稳定,随着发育时间延长,特有miRNAs的表达水平呈总体增加的趋势。利用TargetFinder软件共预测出16479个意蜂幼虫肠道的靶基因,其中有8132和3361个可分别注释到GO和KEGG数据库,进一步分析发现有224个靶基因注释在Wnt信号通路,分别有2个和27个靶基因与保幼激素和蜕皮激素的调控密切相关。【结论】本研究在全基因组水平对意蜂幼虫肠道的miRNAs进行预测和分析,研究结果不仅丰富了意蜂的miRNAs信息,也为深入研究意蜂幼虫肠道的生长发育机理打下了初步基础。     

基于small RNA组学分析揭示意大利蜜蜂响应东方蜜蜂微孢子虫胁迫的免疫应答机制

【目的】通过深度测序和组学分析在small RNA组学层面揭示意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica,简称意蜂)响应东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)的免疫应答机制。【方法】利用small RNA-seq技术对正常及N. ceranae胁迫7 d和10 d的意蜂工蜂中肠(Am7CK、Am7T、Am10CK和Am10T)进行深度测序。利用相关生物信息学软件对测序数据进行质控、已知micro RNA (mi RNA)鉴定、新mi RNA预测及mi RNA的结构特征分析。通过Stem-loop RT-PCR验证新mi RNA的表达。按照|log2(Fold change)|≥1和P≤0.05的标准筛选出Am7CKvs.Am7T和Am10CKvs.Am10T比较组的差异表达mi RNA(differentially expressed mi RNA,DEmi RNA)。利用软件预测DEmi RNA靶向结合的m RNA并进行GO和KEGG数据库注释,根据注释信息对细胞和体液免疫相关通路及富集靶m RNA进行统计和分析。根据靶向结合关系构建DEmi RNA和免疫通路相关差异表达m RNA (differentially expressed m RNA,DEm RNA)的调控网络。采用RT-q PCR对数据的可靠性和DEmi RNA的差异表达进行验证。【结果】共获得165895574条原始读段和132028990条有效序列标签,各组的组内Pearson相关性平均在87.92%及以上。共鉴定到928个已知mi RNA和56个新mi RNA。这些mi RNA的长度介于18–28nt,多数的长度为18nt和22nt且首位碱基主要偏向U。验证了12个新mi RNA的真实表达。Am7CKvs.Am7T比较组包含48个上调mi RNA和36个下调mi RNA;Am10CK vs. Am10T比较组包含56个上调mi RNA和51个下调mi RNA。两个比较组的DEmi RNA可分别靶向结合9827个和10720个m RNA。这些靶m RNA可分别注释到50和47条功能条目,以及138和135条KEGG通路。DEmi RNA与免疫通路相关靶m RNA的调控网络分析结果显示,Am7CK vs. Am7T中有26个DEmi RNA靶向与内吞作用等免疫通路相关的10个DEm RNA;Am10CK vs. Am10T中有15个DEmi RNA靶向与MAPK信号通路等免疫通路相关的10个DEm RNA。验证了测序数据和4个DEmi RNA差异表达的可靠性。【结论】研究结果揭示了宿主DEmi RNA可能通过调控物质和能量代谢、细胞和体液免疫对N. ceranae产生应答,但DEmi RNA不参与抗菌肽基因的表达调控;mi R-1-z可能参与宿主的细胞增殖、细胞凋亡和免疫进程;氧化磷酸化通路可能在宿主免疫应答及宿主-病原互作中发挥特殊作用。     

意大利蜜蜂幼虫肠道内球囊菌及其纯培养的高表达基因差异分析

【背景】球囊菌是一种典型的蜜蜂真菌性病原,特异性地侵染蜜蜂幼虫。目前,有关球囊菌在侵染过程中的基因表达规律的信息极为有限。【目的】通过深入分析胁迫意大利蜜蜂(意蜂)幼虫肠道的球囊菌及其纯培养的高表达基因(HEGs)差异,探索球囊菌在胁迫意蜂幼虫肠道后期与胁迫前的基因表达规律。【方法】利用RNA-Seq技术对球囊菌胁迫的意蜂6日龄幼虫肠道(Aam T)及球囊菌纯培养(AaCK)进行深度测序,根据FPKM值筛选得到球囊菌的HEGs,进而通过GO(Gene ontology)及KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析、Venn分析对上述HEGs进行功能预测和生物学意义挖掘。【结果】AaCK与Aam T的转录组测序共得到105 447 578条原始读段(Raw reads),经过滤得到88 466 344条有效读段(Clean reads),两端平均Q20为97.50%,平均Q30为93.81%。GO富集分析结果显示,AaCK的HEGs富集于26个GO terms,基因富集数最多的是细胞(22 Unigenes),其次是细胞组件(22 Unigenes)和代谢过程(21 Unigenes);Aam T的HEGs富集于22个GO terms,基因富集数最多的是催化活性(23 Unigenes),其次是细胞进程(18 Unigenes)和代谢过程(18 Unigenes)。KEGG代谢通路(Pathway)富集分析显示,AaCK的HEGs富集在109个Pathways上,基因富集数最多的是核糖体(179 Unigenes),其次是氨基酸生物合成(70Unigenes)和碳代谢(62 Unigenes);Aam T的HEGs富集在114个Pathways上,基因富集数量最多的是核糖体(178 Unigenes),其次是碳代谢(116 Unigenes)和氧化磷酸化(112 Unigenes)。Venn分析结果显示,AaCK与Aam T共有的HEGs有260个,二者特有的HEGs分别为2 161个和4 445个。【结论】提供了胁迫意蜂6日龄幼虫肠道的球囊菌及其纯培养的HEGs表达谱,揭示了球囊菌在胁迫前和胁迫后期的基因表达规律,也为阐明球囊菌致病的分子机理提供了有益的信息和线索。     

球囊菌胁迫中华蜜蜂幼虫肠道过程中病原的转录组学研究

【目的】本研究利用RNA-seq技术对球囊菌胁迫的中华蜜蜂(中蜂)幼虫肠道进行深度测序,经趋势分析得到差异表达基因(DEGs)的显著表达模式,进而对胁迫过程中的球囊菌进行转录组学分析。【方法】利用Illumina HiSeq 2500平台对球囊菌胁迫的中蜂幼虫肠道进行深度测序,并利用相关软件进行了深入分析。最后,通过RT-qPCR对RNA-seq数据进行了验证。【结果】本研究共得到球囊菌的41133932条高质量clean reads。22865个DEGs共聚类为8个基因表达模式,其中,16769个DEGs聚类为2个显著上调趋势与2个显著下调趋势。GO富集分析结果显示,显著上调与显著下调趋势中的DEGs分别富集于40与37个GO term,基因富集数最多的为细胞进程(2486 unigenes)。KEGG代谢通路(pathway)富集分析结果显示,显著上调与显著下调趋势中的DEGs分别富集于119和112个pathway,基因富集数最多的分别是氨基酸生物合成(127 unigenes)与核糖体(98 unigenes)。进一步分析表明球囊菌在胁迫中蜂幼虫肠道的过程中通过提高物质合成促进其增殖,而宿主通过抑制球囊菌的蛋白合成抵御病原入侵。富集在MAPK信号通路的11个DEGs的表达水平随着胁迫时间的延长而逐渐下降,推测中蜂幼虫通过抑制该通路而阻遏球囊菌增殖。【结论】本研究不仅为揭示白垩病过程中的球囊菌-中蜂幼虫互作提供了重要信息,也为阐明不同抗性蜂种的球囊菌抗性差异奠定了基础。     

侵染中华蜜蜂6日龄幼虫的蜜蜂球囊菌的微小RNA差异表达谱及调控网络

【目的】蜜蜂球囊菌(Ascosphaeraapis,简称球囊菌)是专性侵染蜜蜂幼虫的致死性真菌病原。MicroRNA(miRNA)作为一类重要的基因表达调控因子,能够广泛参与真菌及其宿主的相互作用过程。本研究通过比较分析球囊菌孢子(AaCK)和侵染中华蜜蜂(Apis cerana cerana,简称中蜂) 6日龄幼虫肠道内的球囊菌(AaT)的smallRNA(sRNA)组学数据对球囊菌的差异表达miRNA(differentiallyexpressed miRNA,DEmiRNA)、靶mRNA及二者间的调控网络进行全面解析,旨在揭示miRNA介导的球囊菌对中蜂幼虫的侵染机制。【方法】对于球囊菌侵染的中蜂6日龄幼虫肠道的small RNA-seq (sRNA-seq)数据,利用BLAST工具连续比对东方蜜蜂(Apiscerana)和球囊菌的参考基因组筛滤得到AaT的sRNA组学数据。分别将AaCK和AaT的sRNA组学数据比对miRBase数据库,对球囊菌侵染宿主前后miRNA的数量和结构特征进行分析。联用RNAhybrid+svm_light、Miranda和TargetScan软件预测AaCK vs AaT比较组中DEmiRNA的靶mRNA,进而利用相关生物信息学软件对上述靶mRNA进行GO分类和KEGG代谢通路富集分析。通过Cytoscape软件对DEmiRNA-mRNA调控网络进行可视化。利用Stem-loop RT-PCR、RT-qPCR和分子克隆验证测序结果的可靠性。【结果】在AaCK和AaT中分别鉴定到380和387个miRNA。结构特征分析结果显示,AaCK和AaT的mi RNA皆集中分布在18–25 nt,且首位碱基主要偏向于U。AaCKvsAaT比较组共有270个DEmiRNA,包含155个上调miRNA和115个下调miRNA,分别靶向结合6091和6145个mRNA。GO分类结果显示,上述靶mRNA主要涉及代谢进程、细胞进程、应激反应等15个生物学进程;细胞、细胞组分、细胞器等12个细胞组分;催化活性、结合、转运子活性等11个分子功能。KEGG代谢通路富集分析结果显示,上述靶mRNA富集在123条代谢通路,参与对氨基酸代谢、碳水化合物代谢以及核苷酸代谢等物质代谢,氧化磷酸化、硫代谢、氮代谢等能量代谢,以及MAPK和Hippo等信号通路的调控。球囊菌DEmiRNA与靶mRNA之间存在复杂的调控关系,其中miR-29-x、miR-250-x、miR-4968-y、miR-11200-x、novel-m0023-5p、novel-m0130-5p和novel-m0135-5p等DEmiRNA可靶向结合与球囊菌的半胱氨酸蛋白酶、DNA甲基化转移酶以及几丁质酶相关的mRNA;此外,miR-7-x、miR-9-z、miR-319-y和miR-5951-y等同时参与调控MAPK信号通路;进一步分析发现,miR-250-x同时参与对DNA甲基化转移酶、MAPK信号通路及其他酶类合成与代谢途径的调控,并可能参与球囊菌与中蜂6日龄幼虫之间的跨界调控。通过Stem-loopRT-PCR和RT-qPCR验证了4个DEmiRNA的差异表达,并利用分子克隆和Sanger测序证实miR-7-x的序列与测序结果一致。【结论】本研究解析了侵染中蜂6日龄幼虫的球囊菌的miRNA差异表达谱及DEmiRNA的调控网络,揭示了球囊菌DEmiRNA可能通过调控病原的物质和能量代谢、增殖、毒力、信号通路及相关mRNA参与对中蜂幼虫的侵染过程。miR-7-x、miR-250-x、novel-m0023-5p等关键DEmiRNA有望作为白垩病治疗的新型分子靶点。     

蜜蜂球囊菌的microRNA鉴定及其调控网络分析

【目的】本研究利用small RNA-seq技术对球囊菌的纯培养进行测序,对球囊菌的micro RNAs miRNAs)进行预测、鉴定和分析,进而构建miRNAs-mRNAs的调控网络。【方法】利用Illumina Hiseq Xten平台对球囊菌菌丝与孢子进行测序,通过相关生物信息学软件对球囊菌的miRNAs进行预测和分析,通过茎环(Stem-loop)PCR对部分miRNAs进行鉴定,利用Cytoskype软件构建miRNAs-mRNAs的调控网络。【结果】本研究共获得48268696条clean reads,预测出118个球囊菌的miRNAs,它们的长度分布介于18–25 nt之间,不同长度的mi RNA的首位碱基偏好性差异明显。Stem-loop PCR验证结果显示共有10个miRNAs能够扩增出符合预期的目的片段,说明多数miRNAs可能真实存在。共预测出6529个球囊菌miRNAs的靶基因,其中5725个能够注释到Nr、Swissprot、KOG、GO和KEGG数据库。进一步分析结果显示有24个靶基因注释在MAPK信号通路。Cytoskype软件分析结果显示球囊菌的miRNAs与mRNAs之间存在复杂的调控网络,绝大多数的miRNAs处于调控网络的内部且同时结合多个mRNAs。【结论】本研究率先对球囊菌的miRNAs及miRNAs-mRNAs调控网络进行全面分析,研究结果丰富了对球囊菌miRNAs的认识,为其基础生物学信息提供了有益补充,也为阐明球囊菌致病的分子机理打下了一定基础。     

中华蜜蜂幼虫肠道响应球囊菌胁迫的microRNA应答分析

【目的】蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis,简称球囊菌)是一种能够侵染中华蜜蜂(Apis cerana cerana,简称中蜂)幼虫的致死性真菌病原。微小RNA(microRNA,miRNA)可通过在转录后水平靶向抑制或降解mRNA而参与宿主与病原互作过程。本研究旨在对球囊菌胁迫的中蜂6日龄幼虫肠道的差异表达miRNA(DEmiRNA)及其靶基因进行深入分析,进而揭示DEmiRNA在中蜂响应球囊菌胁迫应答过程中的作用。【方法】利用Illumina MiSeq平台对正常及球囊菌胁迫的中蜂6日龄幼虫肠道(AcCK和AcT)进行测序,通过相关生物信息学软件预测DEmiRNA及其靶基因。通过Blast将靶基因注释到GO和KEGG数据库。利用Cytoscape软件构建DEmiRNA与其靶mRNA的调控网络。通过Stem-loop RT-PCR和qPCR验证测序数据的可靠性。【结果】本研究共预测出537个miRNA,其长度分布介于16–35 nt之间,且不同长度的miRNA首位碱基偏向性差异明显。通过Stem-loop RT-PCR证实了10个novel miRNA的表达。AcCK vs AcT比较组共有54个DEmiRNA,包含31个上调和23个下调miRNA,可分别靶向结合6170和8199个靶基因。GO分类结果显示上调和下调miRNA的靶基因分别涉及47和47个条目,富集基因数最多的皆为结合细胞进程和催化活性。KEGG代谢通路(pathway)富集分析结果表明上调和下调miRNA的靶基因分别富集在134和126条pathway,富集基因数最多的均为内吞作用和内质网中的蛋白质加工。调控网络分析结果表明,DEmiRNA及其靶mRNA形成十分复杂的调控关系;31个DEmiRNA可靶向结合51个与泛素介导的蛋白水解相关的mRNA,18个DEmiRNA可靶向结合14个与Jak-STAT信号通路相关的mRNA;miR-1277-x、miR-26-x、miR-27-y、miR-30-x、miR-6052-x等16个miRNA共同参与了上述两条免疫通路的调控。最后,随机挑选3个DEmiRNA进行qPCR验证,结果证明了测序数据的可靠性。【结论】本研究提供了中蜂幼虫肠道在球囊菌胁迫后期的miRNA的表达谱和差异表达信息,揭示了球囊菌与宿主之间在miRNA组学水平存在复杂的互作。miR-6052-x和miR-1277-x作为调控网络的核心可能通过影响细胞凋亡参与宿主的免疫防御,miR-26-x和miR-30-x可能通过调控Jak-STAT信号通路参与宿主的胁迫应答。本研究筛选出的关键DEmiRNA有望作为治疗白垩病的分子靶标。     

环状RNA ame_circ_000115调节蜜蜂球囊菌胁迫下意大利蜜蜂幼虫肠道基因表达

环状RNA (circular RNA, circRNA)是一类新型非编码RNA,已被证实可通过竞争性内源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)调控网络等多种方式参与调节昆虫基因表达和免疫应答。目前,circRNA在蜜蜂免疫应答中的作用尚不清楚。本研究对意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica,简称意蜂)ame＿circ＿000115(简称ac115)的反向剪切(back splicing,BS)位点进行验证。采用RT-qPCR检测蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis)胁迫下意蜂幼虫肠道内ac115的表达谱,利用双荧光素酶报告基因试验验证ac115与ame-miR-13b的结合关系。通过饲喂特异性siRNA对蜜蜂球囊菌胁迫的意蜂幼虫肠道内ac115进行干扰,进而检测干扰ac115对宿主免疫应答相关的6个基因表达量的影响。结果表明,ac115的BS位点真实存在;相较于未接种组,蜜蜂球囊菌接种组4日龄幼虫肠道内ac115的表达量极显著上调(P<0.000 1),5和6日龄幼虫肠道内ac115显著上调表达(P<0.05)...     

意大利蜜蜂工蜂幼虫nkd基因的生物信息学分析及功能研究

【目的】意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica,简称意蜂)是西方蜜蜂(Apis mellifera)的亚种之一。蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis)侵染意蜂幼虫导致白垩病。本研究对西方蜜蜂裸表皮蛋白(naked cuticle, Nkd)进行保守基序预测和系统进化分析,并通过RNAi明确nkd基因对意蜂工蜂幼虫体重及宿主响应蜜蜂球囊菌胁迫的免疫应答的影响,以期丰富西方蜜蜂基因nkd的信息,并揭示意蜂幼虫nkd的功能。【方法】通过MEME软件预测西方蜜蜂和其他9个物种Nkd蛋白的保守基序。采用MEGA X软件对西方蜜蜂及其他9个物种的Nkd蛋白进行系统进化分析。通过饲喂dsRNA对意蜂幼虫肠道内的nkd进行RNAi。使用电子天平对幼虫进行称重。利用RT-qPCR检测nkd基因的干扰效率及免疫基因的相对表达量。【结果】西方蜜蜂与东方蜜蜂、柑橘凤蝶、家蚕和金凤蝶的Nkd蛋白均含有3个保守基序(motif 1、motif 2 和motif 3),说明上述5个昆虫物种的Nkd具有较高的保守性。西方蜜蜂与东方蜜蜂的Nkd蛋白聚为一支,说明二者的亲缘关系近。与dsRNA-egfp组相比,dsRNA-nkd组5日龄和6日龄幼虫肠道内nkd的表达量均极显著下调(P<0.001),干扰效率分别为49.60%和56.40%。另外,dsRNA-nkd组幼虫体重较dsRNA-egfp组显著下降,说明nkd显著影响幼虫体重。RT-qPCR结果显示,4日龄幼虫肠道内abaecin、apidaecin、birc5、defensin-1和PGRP-S2均被激活表达;5日龄幼虫肠道内abaecin、apidaecin、birc5和defensin-1均被激活表达,PGRP-S2的表达受到抑制;6日龄幼虫肠道内abaecin被激活表达,而apidaecin、birc5、defensin-1和PGRP-S2的表达均受到抑制,说明上述5个免疫基因在宿主响应胁迫的过程中呈不同的表达趋势,均参与宿主的免疫应答,nkd与abaecin和apidaecin的表达存在负向调控关系。【结论】西方蜜蜂的Nkd蛋白含有3个保守基序(motif 1、motif 2和motif 3),西方蜜蜂与东方蜜蜂的Nkd蛋白亲缘关系最近,通过饲喂dsRNA能有效干扰意蜂工蜂幼虫肠道内nkd表达,nkd影响意蜂工蜂幼虫体重及宿主对蜜蜂球囊菌胁迫的免疫应答。     

胁迫意大利蜜蜂幼虫肠道的球囊菌的转录组分析

【目的】本研究旨在通过趋势分析对胁迫意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica(简称意蜂)幼虫肠道的球囊菌Ascosphaera apis的差异表达基因(DEGs)进行转录组分析。【方法】将纯化的球囊菌孢子配制为1×107孢子/m L的饲料饲喂意蜂3日龄幼虫,利用Illumina Hi Seq 2500平台对球囊菌胁迫的意蜂幼虫肠道c DNA进行测序,将过滤得到的有效读段(clean reads)映射(mapping)到核糖体数据库及意蜂参考基因组,最后将未映射上的reads映射到本课题组组装并注释的球囊菌参考转录组。利用STEM软件对DEGs进行趋势分析。利用WEGO软件对显著表达模式中的DEGs进行GO富集分析。利用Blastall对显著表达模式中的DEGs进行KEGG代谢通路富集分析。最后,通过对随机选取的6个DEGs进行RT-q PCR分析,对RNA-seq数据进行验证。【结果】球囊菌胁迫意蜂幼虫肠道样品的Illumina测序共得到球囊菌的25 454 076条原始读段(raw reads),经过滤得到24 909 820条clean reads,Q30均在93.46%以上。趋势分析结果显示,19 893个DEGs聚类为8个表达模式,其中有12 151个DEGs聚类为3个表现为显著上调趋势的表达模式。GO富集分析结果显示,表现上调趋势的DEGs富集在40个GO term,富集基因数最多的为细胞进程(cellular process)(2 601 unigenes),其次为代谢进程(metabolic process)(2 553 unigenes)和细胞(cell)(2 522unigenes)。KEGG代谢通路富集分析结果显示,上调趋势中的DEGs富集在119个代谢通路上,其中富集基因数最多的是核糖体(ribosome)(213 unigenes),其次为氨基酸生物合成(biosynthesis of amino acids)(154 unigenes)和内质网蛋白加工(protein processing in endoplasmic reticulum)(130unigenes)。共有48个DEGs富集在MAPK信号通路上,聚类分析结果显示,这些DEGs随着胁迫时间的延长表达水平逐渐增强。RT-q PCR结果显示,6个DEGs的表达水平变化趋势与RNA-seq数据一致,证明了本研究中的转录组数据真实可靠。【结论】本研究为在分子水平揭示球囊菌的致病机理提供了重要信息,也为阐释球囊菌胁迫意蜂幼虫过程中的病原-宿主互作机制奠定了基础。     

参与调控意大利蜜蜂工蜂中肠基因表达的东方蜜蜂微孢子虫miRNA的组学解析及其调控网络

【目的】本研究结合前期已获得的miRNA和mRNA组学数据对东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae的差异表达miRNA(differentially expressed miRNA, DEmiRNA)靶向意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica工蜂中肠的mRNA和差异表达mRNA(differentially expressed mRNA, DEmRNA)进行生物信息学预测、数据库注释和调控网络分析,旨在解析东方蜜蜂微孢子虫对意大利蜜蜂工蜂中肠的基因表达调控。【方法】比较东方蜜蜂微孢子虫感染7 d(AmT1)和10 d(AmT2)的意大利蜜蜂工蜂中肠和未感染中肠(分别为AmCK1和AmCK2)的mRNA数据,筛选意大利蜜蜂工蜂的显著性DEmRNA;通过比较侵染AmT1和AmT2的东方蜜蜂微孢子虫(分别为NcT1和NcT2)和东方蜜蜂微孢子虫纯净孢子(NcCK)的miRNA数据筛选出东方蜜蜂微孢子虫的DEmiRNA。利用TargetFinder软件预测东方蜜蜂微孢子虫DEmiRNA靶向的意大利蜜蜂工蜂中肠DEmRNA。利用相关生物信息学工具对上述意大利蜜蜂工蜂中肠靶DEmRNA进行GO和KEGG数据库注释。根据KEGG数据库注释信息筛选出意大利蜜蜂工蜂中肠免疫防御和能量代谢通路相关DEmRNA,并构建和分析上述DEmRNA与相应的东方蜜蜂微孢子虫DEmiRNA之间的调控网络。【结果】NcCK vs NcT1比较组中东方蜜蜂微孢子虫的77条显著上调miRNA和52条显著下调miRNA可分别靶向AmCK1 vs AmT1比较组中意大利蜜蜂工蜂中肠的118条显著下调mRNA和135条显著上调mRNA,这些mRNA可分别注释到31和25个GO条目,以及113和107条KEGG通路。NcCK vs NcT2比较组中东方蜜蜂微孢子虫的52条显著上调miRNA和49条显著下调miRNA可分别靶向AmCK2 vs AmT2比较组中意大利蜜蜂工蜂中肠的97条显著下调mRNA和210条显著上调mRNA,这些mRNA可分别注释到27和30个GO条目以及97和127条KEGG通路。NcCK vs NcT1和NcCK vs NcT2比较组中的11条共同显著上调miRNA和19条共同显著下调miRNA分别靶向AmCK1 vs AmT1和AmCK2 vs AmT2比较组的6条共同显著下调和14条共同显著上调mRNA,可分别注释到7和10个GO条目以及0和9条KEGG通路。NcCK vs NcT1和NcCK vs NcT2比较组中东方蜜蜂微孢子虫的DEmiRNA可靶向AmCK1 vs AmT1和AmCK2 vs AmT2比较组中意大利蜜蜂工蜂中肠的氧化磷酸化和硫代谢等能量代谢通路相关DEmRNA,以及胞吞作用、黑色素生成、溶酶体、自噬、Toll样受体信号通路、细胞凋亡、Ras信号通路、泛素介导的蛋白水解和MAPK信号通路等免疫防御通路相关DEmRNA。进一步分析发现,miR-216-x, miR-5119-y, bantam-y和miR-8-y在NcCK vs NcT1和NcCK vs NcT2比较组中皆显著上调表达,且靶向意大利蜜蜂工蜂中肠的溶酶体、黑色素生成、泛素介导的蛋白水解、MAPK信号通路及Ras信号通路等免疫防御通路相关的显著下调mRNA。【结论】在侵染过程中,东方蜜蜂微孢子虫的DEmiRNA对意大利蜜蜂工蜂的基因表达具有广泛的潜在影响,东方蜜蜂微孢子虫可能通过上调部分miRNA跨界调控意大利蜜蜂工蜂的免疫防御以促进侵染,通过下调部分miRNA跨界调控意大利蜜蜂工蜂的能量代谢以加强能量窃取并促进增殖。     

球囊菌侵染对意大利蜜蜂幼虫肠道免疫与解毒相关基因表达及蛋白质、脂质和糖类含量的影响

【目的】球囊菌Ascosphaera apis是一种真菌性病原体,可以侵染意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica幼虫,导致蜂群患白垩病。本研究通过球囊菌侵染意大利蜜蜂幼虫,探究对意大利蜜蜂幼虫肠道免疫解毒相关基因表达及蛋白质、脂质和糖类含量的影响,分析球囊菌侵染胁迫下意大利蜜蜂免疫应答反应与营养物质的关系。【方法】实验室饲养意大利蜜蜂幼虫,处理组每头3日龄幼虫接种2×10⁶孢子/mL球囊菌,对照组饲喂正常食物;收集6日龄幼虫肠道样品。通过qRT-PCR测定收集的肠道样品中免疫、解毒、发育相关基因和病原基因的表达,并利用生化方法测定肠道样品中蛋白质、脂质、葡萄糖和糖原含量。【结果】球囊菌侵染意大利蜜蜂后,幼虫肠道免疫相关基因LOC406144, Apid1, Def1, Def2, LOC406142, PGRP-SA, Pgrp-s2, PGRP-S3, PGRP-lc, GNBP-1, GNBP3, PPOact, LOC552247, domeless, KAT2A和bsk显著上调表达,cactus显著下调表达;解毒相关基因Cat, GSTS3, Cyp4g11, LOC725294, Ampka-r1, LOC411223, LOC409791, AmNOS和Sod2显著上调表达,CYP6AS14, CPR14, CYP306A1和LOC100576555显著下调表达;发育相关基因usp显著上调表达,VGMC, HEX70b和Vg显著下调表达;病原基因BQCV capsid protein和Ascosphaera apis 28S rRNA表达量显著上升;蛋白质与脂质含量显著下降,葡萄糖与糖原含量显著上升。【结论】球囊菌侵染意大利蜜蜂幼虫后影响其幼虫肠道中免疫、解毒、发育相关基因和病原基因的表达,影响意大利蜜蜂的免疫应答及能量应激反应,加速蛋白质、脂质的流失及葡萄糖和糖原能量储备,影响机体正常的生理活动。     

三种微小RNA在意大利蜜蜂工蜂蛹期发育过程中的表达谱及潜在功能

[目的]意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica是生产性能优良的西方蜜蜂Apis mellifera亚种.本研究旨在利用分子生物学手段揭示3种微小RNA(microRNA,miRNA) ame-miR-13b,ame-miR-100和ame-miR-bantam调控蛹期变态发育的分子机理.[方法]通过...     

ame-miR-14在意大利蜜蜂工蜂幼虫肠道发育过程的调控作用

【目的】本研究旨在揭示ame-miR-14在意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica工蜂幼虫肠道发育过程的调控作用。【方法】通过Stem-loop RT-PCR和Sanger测序分别验证ame-miR-14在意大利蜜蜂工蜂6日龄幼虫肠道中的表达和序列真实性。饲喂ame-miR-14的模拟物(mimic-ame-miR-14)和抑制物(inhibitor-ame-miR-14)及其相应的阴性对照mimic-NC和inhibitor-NC对ame-miR-14分别进行过表达和敲降,利用RT-qPCR检测意大利蜜蜂工蜂4-6日龄幼虫肠道中ame-miR-14的表达量。利用生物信息学软件预测ame-miR-14的靶基因并进行相关分析。利用RT-qPCR检测ame-miR-14的过表达和敲降后其靶基因FoxO和Hedgehog在4-6日龄幼虫肠道中的相对表达量。【结果】ame-miR-14在意大利蜜蜂工蜂6日龄幼虫肠道中真实存在和表达。相较于饲喂mimic-NC,饲喂mimic-ame-miR-14后ame-miR-14表达量在意大利蜜蜂工蜂4-6日龄幼虫肠道中均为显著上调;相...     

意大利蜜蜂工蜂幼虫肠道中ame-miR-bantam对靶基因USP和P300的表达调控

【目的】本研究旨在通过饲喂法对意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica工蜂幼虫肠道中ame-miR-bantam进行过表达与敲减,明确ame-miR-bantam对靶基因USP和P300表达的调控作用。【方法】通过饲喂ame-miR-bantam模拟物(mimic-ame-miR-bantam)和抑制物(inhibitor-ame-miR-bantam)及相应的阴性对照mimic-NC-ame-miR-bantam和inhibitor-NC-ame-miR-bantam,对意大利蜜蜂工蜂4-6日龄幼虫肠道组织中的ame-miR-bantam分别进行过表达和敲减。利用生物信息学软件进行ame-miR-bantam的靶向预测及分析。通过RT-qPCR检测4-6日龄意大利蜜蜂工蜂幼虫肠道中ame-miR-bantam的过表达和敲减效果及靶基因USP和P300的相对表达量。【结果】相较于饲喂mimic-NC-ame-miR-bantam,饲喂mimic-ame-miR-bantam后,ame-miR-bantam在意大利蜜蜂4-6日龄工蜂幼虫肠道中均显著上调;相较于饲喂inhibitor-NC-ame-miR-bantam,饲喂inhibitor-ame-miR-bantam后,ame-miR-bantam在4日龄工蜂幼虫肠道中显著下调,在5日龄和6日龄工蜂幼虫肠道中下调表达。ame-miR-bantam共靶向222个基因,可注释到细胞进程等35个GO条目和Wnt信号通路等160条KEGG通路。相比于饲喂mimic-NC-ame-miR-bantam的阴性对照组,过表达ame-miR-bantam后,4日龄工蜂幼虫肠道中USP和P300的表达量均为上调;5日龄工蜂幼虫肠道中USP的表达量下调,P300显著下调表达;6日龄工蜂幼虫肠道中USP和P300均显著下调表达。相比于饲喂inhibitor-NC-ame-miR-bantam的阴性对照组,敲减ame-miR-bantam后,4和5日龄工蜂幼虫肠道中USP和P300的表达量均为上调;6日龄工蜂幼虫肠道中USP显著上调表达,P300的表达量上调。【结论】通过饲喂模拟物和抑制物能够分别实现意大利蜜蜂工蜂幼虫肠道中ame-miR-bantam的有效过表达和敲减;幼虫肠道中ame-miR-bantam可负调控USP和P300的表达。     

ame-miR-79负调控意大利蜜蜂工蜂幼虫肠道中靶基因CYP450和FG的表达

【目的】本研究旨在通过饲喂ame-miR-79的模拟物(mimic)和抑制物(inhibitor)对意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica工蜂幼虫肠道内的ame-miR-79分别进行过表达和敲减,探究ame-miR-79对幼虫肠道内靶基因表达的调控作用。【方法】通过分子克隆与Sanger测序验证意大利蜜蜂工蜂幼虫肠道内ame-miR-79的序列真实性。通过饲喂mimic-miR-79和inhibitor-miR-79对意大利蜜蜂工蜂4-6日龄幼虫肠道内的ame-miR-79分别进行过表达和敲减。采用相关生物信息学软件进行ame-miR-79的靶基因预测与分析。通过RT-qPCR检测ame-miR-79的过表达和敲减效果及过表达和敲减ame-miR-79后靶基因的相对表达量。【结果】ame-miR-79在意大利蜜蜂工蜂幼虫肠道内真实存在。与无义模拟物(nonsense mimic, mimic-NC)组相比,mimic-miR-79组的4-6日龄幼虫肠道内ame-miR-79的表达量皆极显著上调;与无义抑制物(nonsense inhibitor, inhibitor-NC)组相比,inhibitor-miR-79组的4和5日龄幼虫肠道内ame-miR-79的表达量显著下调,6日龄幼虫肠道内ame-miR-79的表达量极显著下调。ame-miR-79共靶向303个基因,涉及27个GO条目和179条KEGG通路。相较于mimic-NC组,靶基因细胞色素P450基因CYP450在mimic-miR-79组的4和5日龄幼虫肠道内均极显著下调表达,而在6日龄幼虫肠道内上调表达;靶基因fringe糖基化转移酶(fringe glycosyltransferase, FG)基因在4日龄幼虫肠道内下调表达,在5日龄幼虫肠道内显著下调表达,而在6日龄幼虫肠道内上调表达。相较于inhibitor-NC组,CYP450在inhibitor-miR-79组的4日龄幼虫肠道内极显著上调表达,在6日龄幼虫肠道内上调表达,而在5日龄幼虫肠道内下调表达;FG的表达水平在4日龄幼虫肠道内显著上调,在5和6日龄幼虫肠道内极显著上调。【结论】ame-miR-79在意大利蜜蜂工蜂幼虫肠道内真实存在;通过饲喂模拟物和抑制物能分别实现意大利蜜蜂工蜂幼虫肠道内ame-miR-79的有效过表达和敲减;ame-miR-79负调控意大利蜜蜂工蜂幼虫肠道内CYP450和FG的表达。     

过表达和敲减ame-miR-13b对意大利蜜蜂幼虫肠道内基因表达的影响

【目的】微小RNA(microRNAs, miRNAs)在昆虫的繁殖、发育和免疫等重要生命活动的调控过程中扮演关键角色。本研究旨在探究在意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica幼虫个体水平过表达与敲减ame-miR-13b对其靶基因表达的影响,为深入探究ame-miR-13b调控意大利蜜蜂幼虫肠道发育的分子机理提供理论和实验依据。【方法】根据ame-miR-13b的核苷酸序列设计合成相应的模拟物mimic-ame-miR-13b和抑制物inhibitor-ame-miR-13b及其对照mimic-NC和inhibitor-NC,混入饲料后饲喂意大利蜜蜂3日龄幼虫,每12 h更换一次饲料,连续饲喂6次,以分别过表达和敲减ame-miR-13b;通过RT-qPCR检测过表达和敲减ame-miR-13b后意大利蜜蜂幼虫肠道中ame-miR-13b及其靶基因Ecr, Egfr和P450 18a1的表达量。【结果】与mimic-NC饲喂组相比, mimic-ame-miR-13b饲喂组中ame-miR-13b在意大利蜜蜂4和6日龄幼虫肠道中均显著上调表达;与饲喂inhibitor-NC组相比,inhibitor-ame-miR-13b饲喂组中ame-miR-13b在4日龄幼虫肠道中下调表达,在5和6日龄幼虫肠道中显著下调表达。与mimic-NC饲喂组相比,过表达ame-miR-13b组中意大利蜜蜂6日龄幼虫肠道中Egfr的表达量显著降低,而Ecr和P450 18a1的表达量均显著升高。与inhibitor-NC饲喂组相比,敲减ame-miR-13b组中意大利蜜蜂6日龄幼虫肠道中Egfr上调表达但不显著,Ecr显著上调表达,而P450 18a1显著下调表达。【结论】通过饲喂法在意大利蜜蜂幼虫个体中成功实现了miRNA的过表达和敲减;ame-miR-13b与Egfr之间存在潜在的负调控关系。     

有翅和无翅豌豆蚜中翅型分化信号通路相关微小RNA及其靶基因的表达差异

【目的】前期研究发现麦长管蚜Sitobion avenae孤雌蚜有翅和无翅个体中存在很多差异表达的微小RNA(microRNA, miRNA),本研究旨在进一步明确这些miRNA在豌豆蚜Acyrthosiphon pisum中发挥作用的发育阶段,探索miRNA调控孤雌蚜翅两型性分化的机制。【方法】选择在麦长管蚜有翅蚜和无翅蚜中显著差异表达,且靶基因为蜕皮激素、胰岛素信号通路及翅型发育关键基因的5个miRNA(Let-7,miR-92a, miR-92b, miR-92a-1-p5和miR-277),利用qPCR检测这些miRNA及其靶标基因在豌豆蚜3-4龄若蚜和成虫有翅和无翅个体中的表达谱;同时利用双荧光素酶活性检测法对上述miRNA的靶基因进行验证。【结果】表达谱分析发现,这5个miRNA在豌豆蚜成虫中表达量均高于其在若蚜中的表达量,而其预测的靶基因在4龄若蚜中的表达量均高于其在成虫中的表达量,表明miRNA对其靶基因的调控作用可能集中在成虫阶段。分析豌豆蚜有翅和无翅个体中5个miRNA的表达情况发现,在成虫有翅个体中5个miRNA的表达量均高于无翅个体中的,其中miR-277表达差异最显著,成虫有翅个体中的表达量是无翅个体中表达量的7.5倍;其次为Let-7,表达差异达3倍。而Let-7在3龄有翅若蚜和无翅若蚜中表达差异最显著,有翅个体中的表达量是无翅个体中的37.8倍;其次为miR-277,表达差异达7.6倍。比较5个miRNA与其靶基因在豌豆蚜3-4龄若蚜及成虫有翅和无翅个体中的表达发现,miRNA Let-7和miR-92b的表达趋势分别与其靶基因abrupt和Foxo的基本相反。荧光素酶活性检测结果显示,Let-7的真实靶标为abrupt,共转染Let-7模拟物后与对照相比,荧光素酶活性下降53%,达极显著水平。其他miRNA与靶标基因的互作不显著。【结论】首次发现miRNA对豌豆蚜孤雌蚜翅型分化相关基因的调控可能发生在成虫阶段。Let-7可能通过调控abrupt基因参与孤雌蚜翅型分化。该研究为进一步探索miRNA参与孤雌蚜翅两型性分化的机制奠定了基础。