基于PacBio测序数据的蜜蜂球囊菌转录因子、融合基因及RNA编辑事件的鉴定

【目的】本研究旨在利用已获得的PacBio单分子实时(single molecule real-time, SMRT)测序数据对蜜蜂球囊菌Ascosphaera apis菌丝(AaM)和孢子(AaS)中的转录因子(TF)、融合基因和RNA编辑事件进行鉴定和分析,以期丰富蜜蜂球囊菌的相关信息,并为进一步探究它们的功能提供理论依据。【方法】利用BLASTx工具将AaM和AaS的全长转录本序列比对到Nr, Swiss-Prot和KEGG数据库以获得一致性最高的蛋白序列,再利用hmmscan软件将上述蛋白序列比对到Plant TFdb数据库以获得TF的分类及注释信息。采用TOFU软件中的fusion_finder.py程序进行融合基因的预测,进而分析融合基因的序列和位置信息。使用SAMtools预测AaM和AaS中的RNA编辑事件,再利用ANNOVAR软件对RNA编辑事件进行注释,进而采用相关生物信息学软件对RNA编辑位点基因进行GO功能和KEGG通路注释。【结果】在AaS中共鉴定到17个TF家族的213个TF,其中C2H2家族包含的TF成员最多。在AaM和AaS中分别鉴定到921和510个融合基因,二者共有的融合基因为510个,特有的融合基因分别为411和0个。在AaM和AaS中分别鉴定到547和191次RNA编辑事件,其中AaM中同义单核苷酸突变的数量最多,AaS中非同义单核苷酸突变的数量最多。此外,在AaM中鉴定到12种碱基替换类型,其中发生C->T的RNA编辑事件数量最多,达到158次;在AaS中鉴定到9种碱基替换类型,其中发生C->T和G->T的RNA编辑事件数量最多,均有42次。AaM和AaS中RNA编辑位点基因分别涉及19和24个GO功能条目;此外还能注释到11和20条KEGG通路。【结论】蜜蜂球囊菌的菌丝和孢子中含有丰富的TF、融合基因和RNA编辑位点;转录因子C2H2家族与蜜蜂球囊菌菌丝和孢子的生长发育和细胞活动具有潜在关联;RNA编辑事件的碱基替换类型在蜜蜂球囊菌和其他物种中具有物种特异性;RNA编辑可能在蜜蜂球囊菌菌丝和孢子的生长和代谢中发挥作用。     

苯并(a)芘与壬基酚对河川沙塘鳢的联合毒性研究

为探究环境内分泌干扰物联合毒性对鱼类的影响,选取苯并芘(benzo[a]pyrene,BaP)及千幕酚(4-nonlyphenol,NP)对河川沙塘鳢Odontobutis potamophila进行单独和联合毒性研究.研究了NP和BaP对河川沙塘鳢血清雌二醇(E2)、卵黄蛋白原(Vtg)、血清谷草转氨酶(GOT)以及肝脏7-乙氧基-3-异吩咏唑酮-脱乙基酶(7-ethoxyresoufin-O-deethylase,EROD)和超氧化物岐化酶(SOD)的影响.结果 表明,BaP单一暴露时,随着BaP剂量浓度的升高雌鱼血清E2含量下降,肝脏EROD活性升高;25 mg/kg BaP试验组雌鱼肝脏EROD活性显著高十对照组;肝脏SOD和血清GOT活性与对照无筹异;NP和BaP联合暴露中,200 mg/kg NP+10 mg/kg BaP、200 mg/kg NP+2 mg/kg BaP试验组雄性个体血清Vtg平均含量比200 mg/kg NP组低50%左右,而血清E2含最显著高于对照组,肝脏EROD酶活性、血清GOT活性变化与BaP剂量浓度呈正相关,而肝脏SOD酶活性则与BaP剂量浓度呈负相关;200 mg/kg NP+25 mg/kg BaP试验组肝脏SOD活性显著低于对照组,而血清GOT活性则显著高于对照组.显示NP和BaP联合作用时BaP可拮抗NP对雄鱼Vtg的诱导效应;200 mg/kg NP+2 mg/kg BaP可导致河川沙塘鳢肝脏肝细胞损伤.     

蜜蜂球囊菌菌丝和孢子中毒力因子相关全长转录本的鉴定及分析

[目的]蜜蜂球囊菌Ascosphaera apis是一种专性侵染蜜蜂幼虫而导致白垩病的致死性真菌病原.基于前期已获得的高质量纳米孔(Nanopore)长读段测序数据,对蜜蜂球囊菌菌丝(AaM)和孢子(AaS)中的毒力因子相关全长转录本进行鉴定和分析,为毒力因子相关剪接异构体的功能研究提供参考信息和基础.[方法]利用BLAST工具,将AaM和AaS中的所有全长转录本比对Nr数据库,以鉴定蜜蜂球囊菌的毒力因子(几丁质酶、脂肪酶、水解酶和蛋白酶)相关的全长转录本.使用minimap2软件,将AaM和AaS中的全长转录本序列与蜜蜂球囊菌参考基因组注释的已知转录本序列进行比对,将比对到参考基因组的全长转录本进行归一化处理,再通过每百万计数法(Counts per million,CPM)计算毒力因子相关全长转录本的表达量.利用百迈克云平台的相关工具绘制转录本的表达量聚类热图.通过IGV浏览器对部分毒力因子相关全长转录本结构进行可视化.[结果]在AaM鉴定到毒力因子相关的367个基因及407个全长转录本,包括12条几丁质酶相关全长转录本,48条脂肪酶相关全长转录本,289条水解酶相关全长转录本,58条蛋白酶相关全长转录本.在AaS鉴定到毒力因子相关367个基因及400个全长转录本,包括14条几丁质酶相关全长转录本,63条脂肪酶相关全长转录本,267条水解酶相关全长转录本,56条蛋白酶相关全长转录本.另外,AaM和AaS特有的毒力因子(几丁质酶、脂肪酶)相关全长转录本分别有0条和17条,共有的毒力因子相关全长转录本有60条.进一步分析发现,蜜蜂球囊菌的部分毒力因子基因可通过可变剪接形成多条剪接异构体.[结论]共鉴定到蜜蜂球囊菌毒力因子(几丁质酶、脂肪酶、水解酶和蛋白酶)相关的367个基因和486条全长转录本;相比于蜜蜂球囊菌参考基因组注释的转录本,绝大多数毒力因子基因对应的全长转录本数量更多且结构更为复杂.研究结果丰富了蜜蜂球囊菌毒力因子相关基因和转录本的注释信息,为毒力因子相关剪接异构体的功能研究提供了基础,也为白垩病防控提供了潜在靶点.     

基于PacBio测序数据的蜜蜂球囊菌SNP与InDel位点发掘及分析

[目的]本研究拟利用已获得的蜜蜂球囊菌Ascosphaera apis菌丝的PacBio单分子实时(single molecule real-time,SMRT)测序数据对蜜蜂球囊菌的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)和插入缺失(insertion-deletion,...     

天麻醒脑胶囊对家兔血小板聚集和花生四烯酸诱导大鼠脑血栓形成的影响

采用比浊方法测定天麻醒脑胶囊在体内和体外对腺苷二磷酸（ADP）、花生四烯酸（arachidonic acid,AA）和血小板活化因子（platelet activating factor,PAF）诱导家兔血小板活化聚集的影响。采用从经大鼠颈内动脉注射诱发同侧大脑半球脑血栓形成方法评价天麻醒脑胶囊的抗脑血栓形成作用。天麻醒脑胶囊在体外呈浓度依赖性明显抑制从和ADP引起的血小板聚集,其半数抑制浓度（50％of inhibitory concentration,IC50）分别为1．83和3．25g/L。0．5和1g/kg的天麻醒脑胶囊于灌胃后明显抑制从诱导的家兔血小板聚集,本品1g/kg时显著阻抑ADP引起的血小板聚集。天麻醒脑胶囊在体内外对PAF诱导的血小板聚集均无明显影响。1、2g/kg天麻醒脑胶囊组的右侧与左侧脑重差值均显著减小,显著降低右脑伊文思蓝吸光度与右脑重的比值。结果提示,天麻醒脑胶囊具有较强的抗血小板和减轻脑血栓形成作用,有利于血小板聚集性增高的血栓栓塞性疾病的防治。     

ame-miR-14在意大利蜜蜂工蜂幼虫肠道发育过程的调控作用

【目的】本研究旨在揭示ame-miR-14在意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica工蜂幼虫肠道发育过程的调控作用。【方法】通过Stem-loop RT-PCR和Sanger测序分别验证ame-miR-14在意大利蜜蜂工蜂6日龄幼虫肠道中的表达和序列真实性。饲喂ame-miR-14的模拟物(mimic-ame-miR-14)和抑制物(inhibitor-ame-miR-14)及其相应的阴性对照mimic-NC和inhibitor-NC对ame-miR-14分别进行过表达和敲降,利用RT-qPCR检测意大利蜜蜂工蜂4-6日龄幼虫肠道中ame-miR-14的表达量。利用生物信息学软件预测ame-miR-14的靶基因并进行相关分析。利用RT-qPCR检测ame-miR-14的过表达和敲降后其靶基因FoxO和Hedgehog在4-6日龄幼虫肠道中的相对表达量。【结果】ame-miR-14在意大利蜜蜂工蜂6日龄幼虫肠道中真实存在和表达。相较于饲喂mimic-NC,饲喂mimic-ame-miR-14后ame-miR-14表达量在意大利蜜蜂工蜂4-6日龄幼虫肠道中均为显著上调;相...     

东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂工蜂过程中nce-miR-12220及其靶基因的表达谱

东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae侵染成年蜜蜂导致蜜蜂微孢子虫病。本研究旨在验证东方蜜蜂微孢子虫nce-miR-12220的存在和表达,并检测nce-miR-12220及其靶基因在病原侵染意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica (简称意蜂)工蜂过程的表达谱。Stem-loop RT-PCR和Sanger测序结果显示nce-miR-12220真实存在和表达。靶向预测结果显示nce-miR-12220共靶向KRAB-A和γ tubulin等15个基因。上述靶基因可注释到19个GO条目和3条KEGG通路。RT-qPCR结果显示,相较于接种后1 d (1 day post infection,1 dpi),nce-miR-12220在2 dpi上调表达,而在3-12 dpi阶段总体表现出显著下调表达的趋势。类似地,与1 dpi相比,靶基因KRAB-A在2 dpi上调表达,而在3-12 dpi阶段总体呈下调表达的趋势。另外,与1 dpi相比,靶基因γ tubulin在2-12 dpi阶段总体表现出显著下调表达的趋势。上述结果表明nce-miR-12220与KRAB-A和γ tubulin之间存在潜在的靶向结合和正向调控关系;东方蜜蜂微孢子虫通过下调表达nce-miR-12220抑制KRAB-A的表达进而促进增殖;意蜂工蜂可能通过抑制东方蜜蜂微孢子虫的γ tubulin表达抵御病原侵染。研究结果明确了nce-miR-12220及其靶基因KRAB-A和γ tubulin在东方蜜蜂微孢子虫侵染意蜂工蜂过程中的动态表达规律,为深入探究nce-miR-12220在病原侵染中的功能及调控机制提供了理论和实验依据。     

中华蜜蜂细胞色素P450基因及其全长转录本的鉴定及分析

【目的】利用纳米孔(nanopore)测序技术鉴定中华蜜蜂Apis cerana cerana工蜂幼虫肠道中细胞色素P450(cytochrome P450, CYP450)基因及其全长转录本,为后续功能研究提供参考信息和基础。【方法】通过Nanopore PromethION平台对中华蜜蜂工蜂4-6日龄幼虫肠道进行转录组测序。利用Guppy软件对原始读段(raw reads)进行质控以得到有效读段(clean reads)。通过识别两端引物鉴定全长转录本序列。使用BLAST工具将上述全长转录本的序列比对到Nr和GO数据库以鉴定CYP450基因及其全长转录本。采用Astalavista软件鉴定基因的可变剪接(alternative splicing, AS)事件。通过RT PCR验证不同类型AS事件的可靠性。【结果】在中华蜜蜂工蜂4-6日龄幼虫肠道中分别测得7 338 627, 7 003 419和7 434 233条原始读段,经质控得到的有效读段数分别为7 289 494, 6 959 880和7 387 756条。鉴定到的非冗余全长转录本总数为48 200条。共鉴定到47个CYP450基因和265条CYP450基因全长转录本。共鉴定到CYP450基因的90次AS事件,包括36次外显子跳跃事件、20次可变5′端剪接位点事件、17次内含子保留事件、9次可变3′端剪接位点事件及8次外显子互斥事件。RT PCR结果证实随机选取的3种AS事件类型真实可靠。【结论】鉴定了中华蜜蜂的CYP450基因及其全长转录本,补充了东方蜜蜂参考基因组的相关注释,并揭示中华蜜蜂CYP450基因可通过多种AS类型产生丰富的剪接体。     

意大利蜜蜂工蜂中肠SNP和InDel突变位点的挖掘及分析

本研究利用已获得的意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica工蜂中肠的转录组数据对意蜂的单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism, SNP）和插入缺失（Insertion-Deletion, InDel）突变位点进行挖掘和分析,共鉴定到232 678个SNP位点,其中发生转换和颠换的SNP位点数分别为196 087和36 591个;最丰富的突变类型是G/A,最少的突变类型为T/G;分布在内含子的SNP位点最多,其次为外显子和基因间区;密码子突变类型为同义突变的SNP位点数最多,其次是非同义突变、终止子增加和终止子减少;此外,SNP位点所在基因可注释到 50个 GO条目和351条KEGG通路。共鉴定到38 715个InDel位点,最丰富的突变类型为移码插入,其次是移码缺失;分布InDel位点数较多的基因组区域为内含子和基因间区;另外,InDel位点所在基因可注释到50个功能条目和340条通路。研究结果丰富了西方蜜蜂Apis mellifera的SNP和InDel位点信息,并为开发和利用意蜂的新型分子标记提供基础。