结合三代测序与二代测序技术揭示蜜蜂球囊菌孢子转录组的复杂性

【目的】蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis)是一种专性侵染蜜蜂幼虫的致死性真菌病原。本研究旨在利用PacBio单分子实时(singlemoleculereal-time,SMRT)测序技术对蜜蜂球囊菌孢子(AaS)中基因的可变剪切(alternative splicing,AS)和可变多聚腺苷酸化(alternative polyadenylation,APA)以及长链非编码RNA (long non-coding RNA,lncRNA)进行鉴定和分析,进而揭示蜜蜂球囊菌孢子中转录组的复杂性。【方法】采用Suppa软件对蜜蜂球囊菌孢子中基因的AS事件进行鉴定。通过RT-PCR对不同类型的AS事件进行验证。采用TAPIS pipeline对蜜蜂球囊菌孢子基因的APA位点进行鉴定。利用MEME软件分析孢子全长转录本的poly(A)剪接位点上游50bp的序列特征并鉴定motif。联用CPC和CNCI软件和比对Swiss-prot数据库的方法预测lncRNA,取三者的交集作为高可信度的lncRNA集合。进一步比较lncRNA和mRNA的转录本长度,外显子数量与长度,内含子长度,GC含...     

东方蜜蜂微孢子虫基因的可变剪接及可变腺苷酸化解析

本研究旨在基于已获得的第三代纳米孔全长转录组数据对东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae基因的可变剪接（alternative splicing,AS）和可变多聚腺苷酸化（alternative polyadenylation,APA）进行分析。通过Astalavista软件鉴定东方蜜蜂微孢子虫基因的AS事件类型。采用TAPIS pipeline对东方蜜蜂微孢子虫基因的APA位点进行鉴定。利用MEME软件分析所有全长转录本的poly (A)剪接位点上游50bp的序列特征并鉴定motif。共鉴定出发生于5个基因的5次AS事件,包括1次可变供体位点（alternative donor site,ADS）和4次内含子保留（intron retention,IR）。鉴定出233个基因发生APA,其中含有1个poly (A)剪接位点的基因数量最多（143,61.37%）。序列特征分析结果显示,东方蜜蜂微孢子虫全长转录本的3’ UTR的上下游表现出明显的碱基倾向性,U在3’ UTR的上游富集,而A在3’ UTR的下游富集。此外,在东方蜜蜂微孢子虫全长转录本的poly (A)剪接位点上游鉴定到3个motif（AAUAAA、UGAUGC和GCGACG）。研究结果揭示了东方蜜蜂微孢子虫转录组的复杂性,完善了现有的参考基因组和转录组注释,也为深入探究不同剪接异构体的分子功能提供了基础。此外,本研究为其他真菌的AS和APA研究提供了有益的思路和方法借鉴。     

基于PacBio测序数据的蜜蜂球囊菌转录因子、融合基因及RNA编辑事件的鉴定

【目的】本研究旨在利用已获得的PacBio单分子实时(single molecule real-time, SMRT)测序数据对蜜蜂球囊菌Ascosphaera apis菌丝(AaM)和孢子(AaS)中的转录因子(TF)、融合基因和RNA编辑事件进行鉴定和分析,以期丰富蜜蜂球囊菌的相关信息,并为进一步探究它们的功能提供理论依据。【方法】利用BLASTx工具将AaM和AaS的全长转录本序列比对到Nr, Swiss-Prot和KEGG数据库以获得一致性最高的蛋白序列,再利用hmmscan软件将上述蛋白序列比对到Plant TFdb数据库以获得TF的分类及注释信息。采用TOFU软件中的fusion_finder.py程序进行融合基因的预测,进而分析融合基因的序列和位置信息。使用SAMtools预测AaM和AaS中的RNA编辑事件,再利用ANNOVAR软件对RNA编辑事件进行注释,进而采用相关生物信息学软件对RNA编辑位点基因进行GO功能和KEGG通路注释。【结果】在AaS中共鉴定到17个TF家族的213个TF,其中C2H2家族包含的TF成员最多。在AaM和AaS中分别鉴定到921和510个融合基因,二者共有的融合基因为510个,特有的融合基因分别为411和0个。在AaM和AaS中分别鉴定到547和191次RNA编辑事件,其中AaM中同义单核苷酸突变的数量最多,AaS中非同义单核苷酸突变的数量最多。此外,在AaM中鉴定到12种碱基替换类型,其中发生C->T的RNA编辑事件数量最多,达到158次;在AaS中鉴定到9种碱基替换类型,其中发生C->T和G->T的RNA编辑事件数量最多,均有42次。AaM和AaS中RNA编辑位点基因分别涉及19和24个GO功能条目;此外还能注释到11和20条KEGG通路。【结论】蜜蜂球囊菌的菌丝和孢子中含有丰富的TF、融合基因和RNA编辑位点;转录因子C2H2家族与蜜蜂球囊菌菌丝和孢子的生长发育和细胞活动具有潜在关联;RNA编辑事件的碱基替换类型在蜜蜂球囊菌和其他物种中具有物种特异性;RNA编辑可能在蜜蜂球囊菌菌丝和孢子的生长和代谢中发挥作用。     

蜜蜂球囊菌的参考转录组de novo组装及SSR分子标记开发

【目的】通过RNA seq技术对纯培养的蜜蜂球囊菌Ascosphaera apis孢子和球囊菌侵染的蜜蜂幼虫肠道组织进行测序,de novo组装球囊菌的参考转录组,并对其进行功能与代谢通路注释,进而基于该转录组数据开发球囊菌的SSR分子标记。【方法】首先通过差速离心获得活化的球囊菌孢子,配制含1×107孢子/m L的饲料饲喂4,5和6日龄的意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica幼虫和中华蜜蜂Apis cerana cerana幼虫,通过Illumina Hi SeqTM2500平台同时对上述蜜蜂幼虫肠道及纯化球囊菌孢子进行深度测序,原始数据过滤后通过Trinity软件组装得到unigenes,进而通过BLASTX比对NCBI Nr,Swiss-Prot,KOG和KEGG数据库对unigenes进行功能与代谢通路注释。利用MISA软件对所有unigenes进行SSR搜索,并利用Primer Premier 5软件设计SSR特异性引物,通过PCR对不同来源的球囊菌SSR位点进行扩增。【结果】本研究共获得146 135 308条高质量reads,de novo组装得到42 609个unigenes。BLASTX比对结果显示,29 316个unigenes在上述公共数据库中具有功能和代谢通路注释。注释到法夫酵母Xanthophyllomyces dendrorhous上的unigenes最多,达6 050个。KEGG注释结果显示,unigenes可注释到117个代谢通路,其中富集在核糖体(ribosome)上的unigenes数量最多(529)。所有unigenes中共预测到7 968个SSRs,通过PCR开发出5个球囊菌SSR分子标记。【结论】本研究成功组装球囊菌的参考转录组,并进行了功能与代谢通路注释,可为在分子水平深入研究球囊菌提供重要的参考信息。基于该转录组信息开发的5个SSR分子标记可推动菌株鉴定、基因图谱构建及基因定位等研究。     

中华蜜蜂细胞色素P450基因及其全长转录本的鉴定及分析

【目的】利用纳米孔(nanopore)测序技术鉴定中华蜜蜂Apis cerana cerana工蜂幼虫肠道中细胞色素P450(cytochrome P450, CYP450)基因及其全长转录本,为后续功能研究提供参考信息和基础。【方法】通过Nanopore PromethION平台对中华蜜蜂工蜂4-6日龄幼虫肠道进行转录组测序。利用Guppy软件对原始读段(raw reads)进行质控以得到有效读段(clean reads)。通过识别两端引物鉴定全长转录本序列。使用BLAST工具将上述全长转录本的序列比对到Nr和GO数据库以鉴定CYP450基因及其全长转录本。采用Astalavista软件鉴定基因的可变剪接(alternative splicing, AS)事件。通过RT PCR验证不同类型AS事件的可靠性。【结果】在中华蜜蜂工蜂4-6日龄幼虫肠道中分别测得7 338 627, 7 003 419和7 434 233条原始读段,经质控得到的有效读段数分别为7 289 494, 6 959 880和7 387 756条。鉴定到的非冗余全长转录本总数为48 200条。共鉴定到47个CYP450基因和265条CYP450基因全长转录本。共鉴定到CYP450基因的90次AS事件,包括36次外显子跳跃事件、20次可变5′端剪接位点事件、17次内含子保留事件、9次可变3′端剪接位点事件及8次外显子互斥事件。RT PCR结果证实随机选取的3种AS事件类型真实可靠。【结论】鉴定了中华蜜蜂的CYP450基因及其全长转录本,补充了东方蜜蜂参考基因组的相关注释,并揭示中华蜜蜂CYP450基因可通过多种AS类型产生丰富的剪接体。     

意大利蜜蜂幼虫肠道内球囊菌及其纯培养的高表达基因差异分析

【背景】球囊菌是一种典型的蜜蜂真菌性病原,特异性地侵染蜜蜂幼虫。目前,有关球囊菌在侵染过程中的基因表达规律的信息极为有限。【目的】通过深入分析胁迫意大利蜜蜂(意蜂)幼虫肠道的球囊菌及其纯培养的高表达基因(HEGs)差异,探索球囊菌在胁迫意蜂幼虫肠道后期与胁迫前的基因表达规律。【方法】利用RNA-Seq技术对球囊菌胁迫的意蜂6日龄幼虫肠道(Aam T)及球囊菌纯培养(AaCK)进行深度测序,根据FPKM值筛选得到球囊菌的HEGs,进而通过GO(Gene ontology)及KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析、Venn分析对上述HEGs进行功能预测和生物学意义挖掘。【结果】AaCK与Aam T的转录组测序共得到105 447 578条原始读段(Raw reads),经过滤得到88 466 344条有效读段(Clean reads),两端平均Q20为97.50%,平均Q30为93.81%。GO富集分析结果显示,AaCK的HEGs富集于26个GO terms,基因富集数最多的是细胞(22 Unigenes),其次是细胞组件(22 Unigenes)和代谢过程(21 Unigenes);Aam T的HEGs富集于22个GO terms,基因富集数最多的是催化活性(23 Unigenes),其次是细胞进程(18 Unigenes)和代谢过程(18 Unigenes)。KEGG代谢通路(Pathway)富集分析显示,AaCK的HEGs富集在109个Pathways上,基因富集数最多的是核糖体(179 Unigenes),其次是氨基酸生物合成(70Unigenes)和碳代谢(62 Unigenes);Aam T的HEGs富集在114个Pathways上,基因富集数量最多的是核糖体(178 Unigenes),其次是碳代谢(116 Unigenes)和氧化磷酸化(112 Unigenes)。Venn分析结果显示,AaCK与Aam T共有的HEGs有260个,二者特有的HEGs分别为2 161个和4 445个。【结论】提供了胁迫意蜂6日龄幼虫肠道的球囊菌及其纯培养的HEGs表达谱,揭示了球囊菌在胁迫前和胁迫后期的基因表达规律,也为阐明球囊菌致病的分子机理提供了有益的信息和线索。     

意大利蜜蜂丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因和全长转录本鉴定及验证

【目的】利用前期获得的高质量纳米孔长读段测序数据对意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因和全长转录本进行鉴定和分析,为深入开展功能研究提供参考信息和基础。【方法】基于前期获得的高质量意大利蜜蜂纳米孔长读段测序数据,通过Blast工具将意大利蜜蜂全长转录本比对Nr数据库筛选出丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因和全长转录本;利用gffcompare软件将筛选出的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶全长转录本与西方蜜蜂A.mellifera参考基因组(Amel＿HAv3.1)上注释的转录本进行比较,以鉴定未注释的新基因和新转录本;使用Astalavista软件鉴定丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因的可变剪接(alternative splicing, AS)事件类型,采用IGV浏览器对剪接体的结构进行可视化,通过RT-PCR验证随机选取的6次AS事件的真实性。【结果】共鉴定到意大利蜜蜂丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶71个基因和335条全长转录本,发掘出未注释的1个新基因和97条新转录本;共对14个已注释基因进行了结构优化,分别延伸了6个基因的5′端和8个基因的3′端。共鉴定到意大利...     

蜜蜂球囊菌的microRNA鉴定及其调控网络分析

【目的】本研究利用small RNA-seq技术对球囊菌的纯培养进行测序,对球囊菌的micro RNAs miRNAs)进行预测、鉴定和分析,进而构建miRNAs-mRNAs的调控网络。【方法】利用Illumina Hiseq Xten平台对球囊菌菌丝与孢子进行测序,通过相关生物信息学软件对球囊菌的miRNAs进行预测和分析,通过茎环(Stem-loop)PCR对部分miRNAs进行鉴定,利用Cytoskype软件构建miRNAs-mRNAs的调控网络。【结果】本研究共获得48268696条clean reads,预测出118个球囊菌的miRNAs,它们的长度分布介于18–25 nt之间,不同长度的mi RNA的首位碱基偏好性差异明显。Stem-loop PCR验证结果显示共有10个miRNAs能够扩增出符合预期的目的片段,说明多数miRNAs可能真实存在。共预测出6529个球囊菌miRNAs的靶基因,其中5725个能够注释到Nr、Swissprot、KOG、GO和KEGG数据库。进一步分析结果显示有24个靶基因注释在MAPK信号通路。Cytoskype软件分析结果显示球囊菌的miRNAs与mRNAs之间存在复杂的调控网络,绝大多数的miRNAs处于调控网络的内部且同时结合多个mRNAs。【结论】本研究率先对球囊菌的miRNAs及miRNAs-mRNAs调控网络进行全面分析,研究结果丰富了对球囊菌miRNAs的认识,为其基础生物学信息提供了有益补充,也为阐明球囊菌致病的分子机理打下了一定基础。     

重寄生枝孢菌SYC63中MYB转录因子鉴定及分析

【背景】V-myb禽成髓细胞瘤病毒癌基因同源物(v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog, MYB)转录因子广泛存在于真菌中,在真菌的胁迫响应与致病性中发挥重要功能。枝孢菌(Cladosporium sp.)作为一类对锈菌有重寄生作用的真菌,具有极高的生防潜力,然而有关其MYB转录因子尚未见报道,对其MYB家族转录因子进行鉴定和表达分析,有助于理解枝孢菌在重寄生过程中发挥的作用。【目的】了解重寄生枝孢菌(Cladosporium cladosporioides) SYC63菌株中MYB转录因子家族种类数目及在重寄生过程中发挥的作用。【方法】利用生物信息学方法对其基本特性进行预测,并结合锈孢子诱导下的表达情况进行分析。【结果】枝孢菌SYC63中包含22个MYB转录因子家族基因,所有MYB转录因子均含有SANT结构域,分子量为28.26-239.05 kDa,等电点(isoelectric point, pI)为4.57-10.15,均为亲水蛋白;大多定位在细胞核,共有1R-MYB和2R-MYB两类,均含有响应病原菌的启动子结合位点...     

Ultrastructural changes in the spore and mycelia of Ascosphaera apis after treatment with benomyl (Benlate 50 W)

In Ascosphaera apis, after 8 days growth in darkness at 28° C, numerous sporocysts were observed, within which mature spores were seen aggregated into a spore ball. The mature spore of A. apis had a thick spore wall with an electron-opaque outer layer, a spore membrane with many depressions, and sporoplasm containing numerous ribosomes and mitochondria. In the cytoplasm of the mycelium, mitochondria with well-defined cristae and numerous ribosomes were observed. At a concentration of 1 g/ml of culture medium, benomyl appeared to inhibit colony growth of A. apis, but some sporocysts containing deformed spores were found. Deformed spores possessed a thick spore wall with a grainy matrix, and depressions were no longer detected in the spore membrane. Ribosomes were lacking in the sporoplasm and mitochondria appeared degenerate. The mycelium from the treated culture contained mitochondria with an electron-lucid matrix and no well defined cristae, while ribosomes were completely depleted. The significance of these observations in relation to the use of benomyl to control chalkbrood disease in the honey bee is discussed.     

中华蜜蜂6日龄幼虫响应蜜蜂球囊菌侵染的长链非编码RNA应答研究

[目的] 本研究旨在探究长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）在中华蜜蜂（Apis cerana cerana,简称中蜂）6日龄幼虫应答蜜蜂球囊菌（Ascosphaera apis,简称球囊菌）侵染过程中的差异表达谱及调控作用。[方法] 利用链特异性cDNA建库的RNA-seq技术对未被侵染及球囊菌侵染的中蜂6日龄幼虫肠道（AcCK和AcT）进行深度测序。通过相关生物信息学软件分析lncRNA的结构特征和表达谱。筛选并分析差异表达lncRNA（differentially expressed lncRNA,DElncRNA）的顺式（cis）作用及竞争性内源RNA（competing endogenous RNA,ceRNA）调控网络。采用RT-qPCR验证测序数据及DElncRNA差异变化趋势的可靠性。[结果] AcCK和AcT共预测出642个已知lncRNA和487个新lncRNA。与蛋白编码基因相比,上述中蜂lncRNA外显子数更少、长度更短且表达量更低。43个antisense lncRNA与40个正义链mRNA之间互补配对。AcCK和AcT比较组包含367个上调lncRNA和268个下调lncRNA。有194个DElncRNA潜在调控461个上下游基因,并涉及细胞进程、代谢进程和催化活性等38个功能条目以及氨基酸代谢、内吞作用和MAPK等191条通路。此外,有180个DElncRNA可靶向结合50个DEmiRNA,进而调控6365个mRNA;三者之间形成较为复杂的ceRNA调控网络。[结论] 中蜂6日龄幼虫肠道的部分lncRNA可作为antisense lncRNA参与应答球囊菌侵染;部分DElncRNA可通过cis作用调节物质代谢和免疫途径相关的上下游基因,从而介导宿主的侵染应答;TCONS_00010661和TCONS_00003104等DElncRNA可通过ceRNA网络调控Jak-STAT和氧化磷酸化等通路及富集基因,进而参与宿主的侵染应答。     

中华蜜蜂幼虫肠道响应球囊菌胁迫的microRNA应答分析

【目的】蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis,简称球囊菌)是一种能够侵染中华蜜蜂(Apis cerana cerana,简称中蜂)幼虫的致死性真菌病原。微小RNA(microRNA,miRNA)可通过在转录后水平靶向抑制或降解mRNA而参与宿主与病原互作过程。本研究旨在对球囊菌胁迫的中蜂6日龄幼虫肠道的差异表达miRNA(DEmiRNA)及其靶基因进行深入分析,进而揭示DEmiRNA在中蜂响应球囊菌胁迫应答过程中的作用。【方法】利用Illumina MiSeq平台对正常及球囊菌胁迫的中蜂6日龄幼虫肠道(AcCK和AcT)进行测序,通过相关生物信息学软件预测DEmiRNA及其靶基因。通过Blast将靶基因注释到GO和KEGG数据库。利用Cytoscape软件构建DEmiRNA与其靶mRNA的调控网络。通过Stem-loop RT-PCR和qPCR验证测序数据的可靠性。【结果】本研究共预测出537个miRNA,其长度分布介于16–35 nt之间,且不同长度的miRNA首位碱基偏向性差异明显。通过Stem-loop RT-PCR证实了10个novel miRNA的表达。AcCK vs AcT比较组共有54个DEmiRNA,包含31个上调和23个下调miRNA,可分别靶向结合6170和8199个靶基因。GO分类结果显示上调和下调miRNA的靶基因分别涉及47和47个条目,富集基因数最多的皆为结合细胞进程和催化活性。KEGG代谢通路(pathway)富集分析结果表明上调和下调miRNA的靶基因分别富集在134和126条pathway,富集基因数最多的均为内吞作用和内质网中的蛋白质加工。调控网络分析结果表明,DEmiRNA及其靶mRNA形成十分复杂的调控关系;31个DEmiRNA可靶向结合51个与泛素介导的蛋白水解相关的mRNA,18个DEmiRNA可靶向结合14个与Jak-STAT信号通路相关的mRNA;miR-1277-x、miR-26-x、miR-27-y、miR-30-x、miR-6052-x等16个miRNA共同参与了上述两条免疫通路的调控。最后,随机挑选3个DEmiRNA进行qPCR验证,结果证明了测序数据的可靠性。【结论】本研究提供了中蜂幼虫肠道在球囊菌胁迫后期的miRNA的表达谱和差异表达信息,揭示了球囊菌与宿主之间在miRNA组学水平存在复杂的互作。miR-6052-x和miR-1277-x作为调控网络的核心可能通过影响细胞凋亡参与宿主的免疫防御,miR-26-x和miR-30-x可能通过调控Jak-STAT信号通路参与宿主的胁迫应答。本研究筛选出的关键DEmiRNA有望作为治疗白垩病的分子靶标。     

球囊菌胁迫中华蜜蜂幼虫肠道过程中病原的转录组学研究

【目的】本研究利用RNA-seq技术对球囊菌胁迫的中华蜜蜂(中蜂)幼虫肠道进行深度测序,经趋势分析得到差异表达基因(DEGs)的显著表达模式,进而对胁迫过程中的球囊菌进行转录组学分析。【方法】利用Illumina HiSeq 2500平台对球囊菌胁迫的中蜂幼虫肠道进行深度测序,并利用相关软件进行了深入分析。最后,通过RT-qPCR对RNA-seq数据进行了验证。【结果】本研究共得到球囊菌的41133932条高质量clean reads。22865个DEGs共聚类为8个基因表达模式,其中,16769个DEGs聚类为2个显著上调趋势与2个显著下调趋势。GO富集分析结果显示,显著上调与显著下调趋势中的DEGs分别富集于40与37个GO term,基因富集数最多的为细胞进程(2486 unigenes)。KEGG代谢通路(pathway)富集分析结果显示,显著上调与显著下调趋势中的DEGs分别富集于119和112个pathway,基因富集数最多的分别是氨基酸生物合成(127 unigenes)与核糖体(98 unigenes)。进一步分析表明球囊菌在胁迫中蜂幼虫肠道的过程中通过提高物质合成促进其增殖,而宿主通过抑制球囊菌的蛋白合成抵御病原入侵。富集在MAPK信号通路的11个DEGs的表达水平随着胁迫时间的延长而逐渐下降,推测中蜂幼虫通过抑制该通路而阻遏球囊菌增殖。【结论】本研究不仅为揭示白垩病过程中的球囊菌-中蜂幼虫互作提供了重要信息,也为阐明不同抗性蜂种的球囊菌抗性差异奠定了基础。     

LncRNA13164通过ace-miR-4968-y调节中华蜜蜂幼虫对蜜蜂球囊菌侵染的免疫应答

【目的】长链非编码RNA (long non-coding RNA,lncRNA)可通过竞争性内源RNA(competing endogenous RNA,ce RNA)等多种方式发挥重要的调控作用,但蜜蜂lncRNA的功能研究至今依然缺失,lncRNA在蜜蜂免疫应答中的作用尚不清楚。本研究旨在揭示中华蜜蜂(Apis cerana cerana,简称中蜂)幼虫响应蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis)侵染的免疫应答中lncRNA的调控功能及作用机制。笔者团队前期通过深度测序和生物信息学分析发现,lncRNA13164与ace-miR-4968存在靶向关系且潜在参与在中蜂幼虫对蜜蜂球囊菌侵染的应答。【方法】利用实时荧光定量PCR (real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测蜜蜂球囊菌接种后中蜂幼虫肠道内lncRNA13164的表达谱。采用ILoc-Lnc RNA软件预测lncRNA13164的亚细胞定位。联用RNAhybrid、Miranda和Target Scan软件预测lnc...