我国部分鸡源H9N2亚型流感病毒NS1基因序列分析

对1996年至2001年间自我国部分养鸡场发病鸡或死亡鸡分离鉴定的8株H9N2亚型禽流感病毒的非结构蛋白基因(NS1)进行了扩增和序列测定,并分析和比较了其核苷酸和氨基酸的同源性。结果表明, NS1基因核苷酸和氨基酸同源性分别为96.5%～99.5% 和94.5～98.6%, 说明NS1基因在遗传进化上高度保守,稳定遗传。与中国香港、韩国、巴基斯坦及人源H9N2分离株相比较,发现中国大陆的鸡源H9N2分离株的NS1基因在其羧基端缺少13个氨基酸。系统进化树分析表明,该8株病毒的NS1基因属于相同的进化分支,而且中国的早年分离株A/chicken/Beijing/1/94位于该进化分支的根部,暗示这些分离株的NS1基因是由A/chicken/Beijing/1/94演化而来;尚未发现NS1基因属于A/quail/Hong Kong/G1/97like分支的分离株。同时,系统进化树也说明了我国的H9N2分离株与韩国、巴基斯坦等地的H9N2分离株隶属于不同的进化分支,H9N2亚型禽流感的发生和流行与地域有一定的相关性。     

鸡源H9N2亚型流行性感冒病毒神经氨酸酶基因序列分析

对1996～2001年间自中国部分养鸡场发病鸡或死亡鸡分离鉴定的8株H9N2亚型禽流感病毒的神经氨酸酶基因(NA),进行了扩增和序列测定,并分析和比较了其核苷酸和氨基酸的同源性.结果表明,NA基因核苷酸和氨基酸同源性分别为97.1%～99.8%和95.7%～99.7%,说明NA基因稳定遗传,高度保守.与A/chicken/HongKong/G9/97相比较,发现中国大陆鸡源H9N2分离株的神经氨酸酶蛋白在其茎部的第63、64、65位点上都有3个氨基酸的丢失,而与中国邻近的韩国、巴基斯坦鸡源H9N2分离株的神经氨酸酶没有氨基酸的丢失,因此这些部位的氨基酸丢失可初步认为是中国大陆H9N2流感病毒分离株的一个标记.系统进化树分析表明,该8株病毒的NA基因属于相同的进化分支,即A/duck/HongKong/Y280/97-like分支,尚未发现NA基因属于A/quail/HongKong/G1/97-like分支的分离株.中国的H9N2分离株与韩国、巴基斯坦等地的H9N2分离株隶属于不同的进化亚分支,说明H9N2亚型禽流感的发生与流行和地域有一定的相关性.     

A型猪流感病毒山东分离株鉴定及其HA基因序列分析

从山东各地疑似流感发病猪分离到10株流感病毒,经国家流感中心鉴定均为A型流感病毒H9N2亚型。将其中一株Sw／SD／1／2003(H9N2)的血凝素全基因(HA)进行克隆与测序,与GenBank收录的其它猪流感和禽流感H9N2亚型的HA基因进行比较,发现Sw／SD／1／2003(H9N2)的血凝素基因在核苷酸序列方面同广西1999年分离的禽流感毒株Ck／GX／99(H9N2)和2000年云南分离的禽流感毒株Ck／YN／2000(H9N2)的同源性最高;进化树分析表明Sw／SD／1／2003(H9N2)起源于禽源的H9N2亚型流感病毒;Sw／SD／1／2003的HA氨基酸裂解位点与其他H9N2亚型不问,Sw／SD／1／2003的HA氨基酸裂解位点是R-S-L-R-G,而其它猪流感和禽流感H9N2亚型都是R-S-S-R-G。     

H5N1亚型高致病性禽流感病毒NS1基因的克隆及其序列分析

目的：克隆H5N1亚型禽流感病毒的NS1基因,并分析其序列特性。方法：通过RT-PCR方法克隆H5N1亚型禽流感病毒NS1基因,并对该基因片段进行测序,将此序列与数据库中不同时间、地点、宿主来源的H5N1亚型流感毒株NS1基因序列进行同源性比较。结果：获得了678bp的NS1全长基因,可编码225个氨基酸;其与毒株A／chicken／Jilin／hq／2003的同源性最高,二者的核酸和氨基酸的同源性分别为99．7％和99．1％。比对分析发现,该毒株NS1基因在第238-252位有15个核苷酸的缺失;进化树分析表明,它与1997年香港流行的H5N1亚型禽流感病毒毒株分别属于2个不同的分支。结论：克隆了一株H5N1亚型禽流感病毒的NS1基因,并初步分析了其序列特性,为进一步研究NS1基因的功能奠定了基础。     

华南流感病毒NS1基因特性研究

为了解H9N2和H5N1亚型流行性感冒病毒株的NS1基因特性,采用RT-PCR方法测定了12株2000～2003年间在华南地区分离的禽流感病毒株的NS1基因核苷酸序列. 测序显示6株H9N2亚型流感病毒NS1基因开放阅读框(ORF)长654 bp,编码217个氨基酸. 6株H5N1亚型毒株NS1基因ORF长678 bp,编码225个氨基酸. 核苷酸和氨基酸同源性分析表明,同一亚型分离株之间有很高的同源性,而不同亚型的H9N2和H5N1毒株之间存在较大差异. BLAST分析表明,H5N1和H9N2亚型流感病毒分离株的NS1基因分别与近两年从香港特区和华南地区的鸭中分离的毒株A/Duck/Hong Kong/646.3/01 (H5N1)、A/Duck/Shantou/2143/01 (H9N2)有很高的亲缘关系. 该研究结果为进一步进行NS1功能研究奠定了基础.     

禽流感病毒分离株NS基因同源性及等位基因类型分析

目的　克隆测定国内具有代表性的禽流感病毒 (AIV)的非结构 (NS)蛋白基因核苷酸序列 ,分析其同源性和等位基因类型 ,为进一步探索禽流感NS蛋白抗体监测方法奠定基础。方法　经RT PCR扩增了国内 3株H9N2、2株H5N1、2株H7N2亚型AIV分离株的NS蛋白基因 ,并把扩增的基因片段克隆到pGEM T载体中测序 ,将测序结果与GenBank中的核苷酸序列进行同源性比较 ,绘制基因进化树。结果　经测序获得了各AIV分离株NS基因的完整编码序列。同源性分析表明 ,3株H9亚型AIV的NS基因之间的同源性为 96 %～ 98% ;两株H5亚型AIVNS基因同源性为 91 6 % ;两株H7亚型AIV的NS基因同源性为 98 9%。H5和H9亚型分离株的NS基因之间的同源性均高于 90 % ;而H7N2亚型分离株与其它两种亚型分离株的NS基因同源性约为 6 0 %～ 70 %。在AIVNS基因系统发育进化树中 ,H5、H9亚型分离株都处于等位基因A群内 ;3株H9亚型分离株的进化关系较近 ,与香港、广东的部分H5N1病毒株起源相同 ,而 2株H5病毒的NS基因则处于不同分枝内 ;2株H7亚型分离株的NS基因都处于等位基因B群内 ,进化关系较近。结论　这 7株国内AIV分离株的NS基因之间的同源性差异较大 ,约为 6 0 %～ 99% ,且包括A、B两种类型的等位基因     

H3亚型鸭源流感病毒聚合酶PB1基因的序列分析

目的阐明H3亚型鸭流感病毒与其他亚型流感病毒的关系。方法对活禽市场分离的3株H3N8亚型鸭源流感病毒聚合酶PB1基因进行了序列分析。结果3株鸭源H3N8流感病毒聚合酶PB1基因核苷酸同源性为99.9%,与H9N2亚型流感病毒(DK/ST/2143/00)的同源性为96.31%~96.44%,而与H3N8亚型鸭流感病毒(Mal/Alberta/279/98)为88.65%~88.79%。系统进化树分析表明,本实验中的3株病毒属于相同的分支,且与A/duck/Hong Kong/Y439为代表的H9N2亚型禽流感病毒位于一进化分支,说明三株H3N8亚型流感病毒重排了H9N2亚型禽流感病毒的基因片段。结论不同亚型禽流感病毒在贮存宿主体内的重排以及重排病毒的新特点如鸭H3N8亚型流感病毒对禽的致病性,应当引起我们的高度重视。     

山东地区16株H9N2亚型禽流感病毒HA基因的序列分析

为了解H9N2亚型禽流感病毒(AIV)山东分离株的遗传变异情况,采用RT-PCR技术对16株从山东不同地区分离的H9N2亚型禽流感病毒的HA基因进行扩增、克隆和测序,并对所获得的HA全序列进行同源性和遗传进化分析。结果显示,16个分离株的裂解位点均为RSSR↓GLF,符合低致病性禽流感病毒的分子特征;有7～9个潜在糖基化位点;受体结合位点除198位有变异,其他位点均较保守;234位氨基酸均为L,具有与哺乳动物唾液酸α,2-6受体结合的特征;16个分离株HA基因核苷酸及氨基酸序列同源性分别为96.3%～99.9%和97.1%～99.6%;16个分离株同属于欧亚分支中的A/Duck/Hong Kong/Y280/97亚群。     

番鸭源H6N6亚型禽流感病毒全基因组的分子特征

【目的】为了丰富水禽源禽流感病毒的分子流行病学资料,明确我国国内首次分离的番鸭源H6N6亚型禽流感(Avian influenza virus,AIV)病毒A/Muscovy Duck/Fujian/FZ01/2008(H6N6)(以下简称MD/FJ/F1/08)全基因组的分子特征,弄清该病毒的遗传进化特点。【方法】对其8个基因片段分别进行扩增和序列测定,并利用分子生物学软件对测序结果进行序列分析。【结果】MD/FJ/F1/08的HA裂解位点附近的氨基酸序列为PSMKVIV↓GL,为非连续的碱性氨基酸,其静脉接种指数(the intravenoys pathogenicity index,IVPI)为0.15,推测其为一株低致病力AIV。其HA基因、NP基因、M基因和PB2基因均与我国台湾分离株A/duck/Kingmen/E322/04(H6N2)该基因的核苷酸同源性最高,分别高达94.2%、95.7%、97.2%和95.6%,均处于同一遗传进化分支。其NA基因和我国远东分离株A/duck/Eastern China/01/2007(H4N6)同源性最高,达97.1%;其颈部有11个氨基酸的缺失(TNSTTTIINNN),为N6亚型神经氨酸酶基因中首次报道,在遗传进化上和H4N6亚型AIV的NA基因处于相同的分支。NS基因和香港地区分离株A/duck/HongKong/3600/99(H6N2)同源性最高,达96.1%;PB1和PA均与高致病性禽流感病毒株A/duck/HongKong/140/1998(H5N1)同源性最高,达95.6%和96.7%。且MD/FJ/F1/08的8基因与H6N6亚型流感病毒北美洲分离代表株均不处在同一遗传进化分支上,相互之间遗传关系较远。【结论】MD/FJ/F1/08可能是由H6N2、H4N6和H5N1等多亚型AIV基因重组而成。     

中国历年H3N2亚型人流行性感冒病毒血凝素基因的序列测定及分析

测定了27株中国1968～2000年的人H3N2亚型流行性感冒(流感)病毒分离株HA1基因的核苷酸全序列,其中包括7株流行代表株:A3/Beijing/1/68、A3/Guangdong/243/72、A3/Beijing/39/75、A3/Guangdong/38/77、A3/Beijing/266/85、A3/Beijing/30/95、A3/Shanghai/1/98.阐明了这些流感病毒分离株的基因结构、变异本质、进化发展过程以及这些毒株与其它分离株之间的遗传进化亲缘关系,为应用生物信息学研究流感病毒基因组变异规律等打下了基础.初步的进化分析表明,历年来的人流感病毒H3N2亚型的起源和进化分为两个分支谱系,并在1984/1985年进行了交替转换;且有一部分人的H3N2亚型分离株其HA1核苷酸序列与猪分离株的进化亲缘关系最为接近.     

A型猪流感病毒山东分离株鉴定及其HA基因序列分析

从山东各地疑似流感发病猪分离到10株流感病毒,经国家流感中心鉴定均为A型流感病毒H9N2亚型.将其中一株Sw/SD/1/2003(H9N2)的血凝素全基因(HA)进行克隆与测序,与GenBank收录的其它猪流感和禽流感H9N2 亚型的HA基因进行比较,发现Sw/SD/1/2003(H9N2)的血凝素基因在核苷酸序列方面同广西1999年分离的禽流感毒株Ck/GX/99(H9N2)和2000年云南分离的禽流感毒株Ck/YN/2000(H9N2)的同源性最高;进化树分析表明Sw/SD/1/2003 (H9N2) 起源于禽源的H9N2亚型流感病毒;Sw/SD/1/2003 的HA氨基酸裂解位点与其他H9N2亚型不同,Sw/SD/1/2003 的HA氨基酸裂解位点是R-S-L-R-G, 而其它猪流感和禽流感H9N2亚型都是R-S-S-R-G.     

一株鹅源H5N2亚型高致病性禽流感病毒的分离鉴定及生物学特性分析

分离到一株鹅源 H5N2亚型高致病性禽流感病毒,SPF鸡静脉接种致病指数为2.99,但鸭子对该病毒不敏感．病毒感染小鼠后不致病,但能够在肺内有效复制,表明其具有感染哺乳动物的潜在风险．血凝素(hemagglutinin, HA)蛋白裂解位点上插入有多个连续的碱性氨基酸(-RRRKKR-),从分子上证实这是一株高致病性禽流感病毒．核酸序列比较分析表明,分离的流感病毒HA基因与A/chicken/Hubei/489/2004 (H5N1)同源率达到99.4%,神经氨酸酶(neuraminidase, NA)基因与A/chicken/Jilin/53/01(H9N2)同源率达到99.8%;氨基酸水平上,HA与2004年分离到的A/chicken/Hubei/489/2004(H5N1)、A/swan/Guangxi/307/2004(H5N1)、A/wildduck/Guangdong/314/　2004(H5N1)和A/chicken/Henan/210/2004(H5N1)同源率均为99.3%,NA 与A/chicken/Jilin/53/01(H9N2)同源率为99.6%．进化树分析结果表明,该流感病毒分离株可能是由H5N1和H9N2两个亚型病毒重排而来．     

甲型N9亚型流感病毒神经氨酸酶基因进化分析

通过对甲型N9亚型流感病毒神经氨酸酶(NA)核苷酸进化趋势的研究,进而探寻2013年新型H7N9亚型禽流感病毒产生的根源。本次研究选取美国国立生物技术信息中心(NCBI)的甲型N9亚型流感病毒的NA序列,采用生物软件ClustalX 2.0和MEGA 6.0建立进化树形图。对其欧亚分支,采用BEAST软件2.1.2和Datamonkey interface在线软件,计算和分析选择压力和进化速率。采用Bioedit软件对NA的氨基酸置换熵值计算并分析。系统进化树表明2013年新型H7N9亚型禽流感病毒可划分至现代欧亚分支之内,并且该分支的每位点每年核苷酸置换速率均值为3.8354×10-3,选择压力dN/dS均值为0.140413。16、19、40、53、81、84、112、256、335、359和401的氨基酸变异位点熵值0.5。研究分析表明2013年新型H7N9亚型禽流感病毒的NA片段基因可能来自甲型N9亚型流感病毒逐步进化的结果,最早可追溯到1996年的A/duck/Siberia/700/1996(H11N9)流感毒株,新型H7N9亚型禽流感病毒来源不是来自外界环境压力引起突变的结果。     

H9N2亚型禽流感病毒NS1基因的进化分析

利用RT-PCR方法,扩增了1998～2005年间分离的9株H9N2亚型禽流感病毒的NS1基因,对其进行了序列测定和进化分析.序列分析表明,9株AIV NS1基因完整的阅读框均为654bp,编码217个氨基酸,其核苷酸和推导的氨基酸同源性分别为95.4%～99.8%和93.6%～100%;9株病毒的NS1蛋白的C端均有13个氨基酸的缺失;进化分析表明,9株AIV属于A群,且形成一个独立分支,在该分支中,只有Ck/HN/A3/98株属于Ck/HK/Y280/97-like亚类,且与Ck/BJ/8/98的进化关系最近,其余8株属于Ck/SH/F/98-like亚类,说明Ck/SH/F/98-like亚类的H9N2亚型AIV在中国大陆的鸡群中广泛存在.NS1基因的进化及其编码产物的特性分析,为AIV的毒力变异、致病机制、药物靶位点的设计及鉴别诊断的研究奠定了基础.     

1株H6N6亚型禽流感病毒分子遗传特性分析

本研究采用无特定病原体(specific pathogen free,SPF)鸡胚,从某活禽市场环境中分离出1株H6N6亚型禽流感病毒(A/environment/Zhenjiang/zj18/2013,en/zj18)。通过二代测序技术进行全基因组测序,通过BLASTn 进行同源性检索,并采用MEGA5.0软件构建系统发生树。基因进化树分析表明,分离株en/zj18的所有8个基因节段(PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS)均与近年来中国华东地区流行的H6N6亚型禽流感病毒的相应基因位于同一进化分支,与参考株的核苷酸同源性达96.7%～99.6%。分离株en/zj18的HA蛋白裂解位点为PQIETR↓GL,是低致病性禽流感病毒的分子特征。HA蛋白上关键受体结合位点190和228位(按H3亚型的HA蛋白序列排序)氨基酸分别是E和G,理论上更易与α2,3-半乳糖苷唾液酸受体结合。结果提示,需加强活禽市场禽流感病毒的持续监测,从而为有效应对禽流感病毒对公共卫生的持续威胁提供科学依据。     

一株H5N2亚型鹦鹉源禽流感病毒分子进化分析

2005年在广东进行流行病学调查时分离到一株鹦鹉源禽流感病毒,经鉴定为H5N2亚型禽流感病毒(A/Parrot/Guangdong/268/2005)。该毒株的HA裂解位点附近的氨基酸序列为RETRGLF,只含有一个碱性氨基酸,符合低致病性禽流感病毒的HA裂解位点附近氨基酸序列的分子特征;与H5N2亚型禽流感代表毒株相比,该毒株HA和NA基因的糖基化位点、HA基因的受体结合位点编码区、NA基因的耐药性位点均未发生变异。将该毒株全基因组序列与GenBank已公布的19株H5N2亚型禽流感病毒株的相应序列进行比较分析并绘制系统进化树后发现:其与低致病性禽流感毒株A/Pheasant/NJ/1355/1998(H5N2)-like的亲缘关系最近,位于以A/Chicken/Pennsylvania/1/1983(H5N2)为代表的美洲进化分支。     

一株H3N2亚型猪流感病毒广东分离株的基因组序列分析

从广东省疑似流感发病猪分离到1株H3N2亚型猪流感病毒(A/Swine/Guangdong/01/2005(H3N2)),对其各个基因进行克隆与测序,并与GenBank中收录的其它猪流感、禽流感和人流感的相关基因进行比较,结果表明,HA全基因与广东2003~2004年分离的H3N2猪流感毒株的核苷酸序列同源性在99%以上,与纽约90年代末分离的H3N2人流感毒株同源性在98.5%以上;NA基因与纽约1998~2000年分离的H3N2人流感毒株的核苷酸序列同源性在99%以上;NS基因、M基因的核苷酸序列与H1N1亚型猪流感毒株A/swine/HongKong/273/1994(H1N1)的核苷酸序列同源性较高,分别为97.9%、98.4%,与美洲A/swine/Iowa/17672/1988(H1N1)的核苷酸序列同源性分别为96.7%、97.1%;其他基因的核苷酸序列与H3N2人流感毒株具有很高的同源性。因此,推测其M和NS基因来源于H1N1亚型猪流感病毒,HA、NA及其他基因均来源于H3N2亚型人流感病毒。表明此H3N2亚型猪流感病毒为H3N2亚型人流感病毒和H1N1亚型猪流感病毒经基因重排而得到的重组病毒。     

家禽市场污水来源的H5N1亚型禽流感病毒NS基因分析

对长沙市家禽市场污水来源的H5N1亚型禽流感病毒(Avian influenza viruses,AIV)的非结构蛋白(Non-structural,NS)基因进行进化和分子特征分析,探讨污水中H5N1病毒的传播风险。9份家禽市场环境污水H5N1亚型AIV标本进行NS基因TA克隆测序,测序结果利用Lasergene和Mega5软件进行氨基酸(amine acid,aa)比对和进化树分析。共得到8个阳性克隆,进化树构建显示8个H5N1的NS基因均属于A亚群,其编码的NS1和NS2蛋白与A亚群代表株(A/chicken/Hubei/w h/1999)aa同源性分别为90.1%～92.5%和91.0%～92.6%,8个H5N1的NS1和NS2aa之间的同源性分别为93.8%～100.0%和98.4%～100.0%。8个H5N1的NS1蛋白均具有缺失80～84位aa、C末端携带有ESEV的PL基序和第92位aa为E的高致病性分子特征。家禽市场污水来源的H5N1亚型AIV的NS基因具有高致病性的分子特征,这种基因特征表明污水可能传播H5N1病毒。     

禽流感病毒A／Chicken／Jiangsu／JS-1／2002（H9N2）分子鉴定与起源分析

运用RT—PCR技术扩增了禽流感病毒A／Chicken／Jiangsu／JS-1／2002（H9N2）完整的血凝素（HA）基因,并克隆到pGEM^R-T载体中,进一步进行了序列测定。序列测定结果已经登陆GenBank,登陆号为AY364228。所扩增的HA基因长度为1683核苷酸,共编码560个氨基酸,其中信号肽长度为18aa,HA1为319aa,HA2为223aa。HA蛋白裂解位点的氨基酸组成为RSSR↓GLF,不舍连续的碱性氨基酸,具有低致病性AIVHA基因裂解位点的序列特征。通过构建一个包含18株H9N2亚型AIV的HA基因遗传进化树,发现所有的18个毒株共可分为欧亚谱系和北美谱系两个谱系,而本分离株在分类地位上国内另外的三个分离株同属于欧亚谱系,在遗传进化上非常接近,表明它们可能具有共同的起源。     

我国部分禽流感病毒H5N1之HA序列变异演化分析

从GenBank上获得我国人(Homo sapiens)、家禽和野鸟42株H5N1亚型禽流感病毒的HA基因核酸序列,利用DNAStar分析HA蛋白关键位点氨基酸残基的变化,比较HA基因核苷酸序列同源性,构建遗传进化树.探讨我国部分人、家禽和野鸟H5N1病毒基因的遗传进化关系.序列分析结果表明:禽流感病毒H5N1亚型的HA基因持续地发生着变异,但并非以均一速度进行,时间间隔愈长,核苷酸同源性愈低;我国同一地区或临近地区,当年或前后两年发生的人及家禽感染的禽流感病毒高度同源.推测我国部分人发生的禽流感可能是通过家禽感染的;候鸟的迁徙在传播病毒过程中所起的作用有待深入探讨.