禽流感病毒NS1蛋白对细胞的影响

NS1蛋白为流感病毒非结构蛋白,只在病毒侵入宿主细胞后产生.目前NS1蛋白对细胞整体水平上的作用仍不清楚,为了解NS1蛋白在病毒感染细胞中的作用,构建了重组质粒pCMV-myc-NS1并将其转染A549细胞,利用双向电泳技术检测了受NS1蛋白调控的宿主蛋白,以期从蛋白质组水平上研究禽流感病毒与宿主细胞间的相互作用.同时,还检测了转染NS1对细胞增殖和细胞周期的影响.结果显示,NS1在细胞中的表达,能够明显引起宿主细胞代谢的变化,并通过阻滞细胞周期的正常进行而减缓细胞的增殖.     

酿酒酵母乙醇脱氢酶2(ADH2)基因的克隆表达及活性验证

为了从酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae中克隆出乙醇脱氢酶2(Alcoholdehy drogenase2,ADH2)基因并使之在大肠杆菌中高效表达。以酿酒酵母细胞中提取的总RNA为模板,通过反转录获得酿酒酵母乙醇脱氢酶2基因,连接到表达载体pTAT上,得到重组表达质粒pTAT-ADH2,将此重组质粒转化到大肠杆菌BL21中,重组工程菌株经IPTG诱导表达得到ADH2蛋白。将该蛋白纯化后,在体外进行活性检测和小鼠体内进行毒理试验,检测ADH2的酶活性。测序结果表明克隆的基因与GenBank中所报道的adh2基因序列有90%的同源性,经SDS-PAGE电泳分析,目的蛋白得到了有效表达,蛋白条带扫描分析表明,表达量占总蛋白的50%左右,纯化得到的蛋白在小鼠体内进行毒理试验,显示出一定的活性。酿酒酵母adh2基因的克隆正确,不仅在大肠杆菌中进行了高效表达而且表现出了较好的酶活性。     

PARP的生物学与病理学功能

PARP1是真核细胞内具有多聚腺苷酸二磷酸核糖基（PAR）催化活性的蛋白酶,目前发现18个具有该活性的蛋白．多聚腺苷酸二磷酸核糖基化反应是细胞内进行的翻译后修饰,该修饰作用于许多蛋白,涉及到染色体的稳定,DNA损伤修复,基因转录,细胞的增长,死亡和凋亡等方面．在生理病理方面与炎症,肿瘤,衰老等疾病相关联．本文针对以上方面进行了总结和讨论．     

PARP10组织分布、相互作用蛋白及UV应激反应的分析

根据GenBank中公布的人多聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶10(PARP10)cDNA序列,设计并合成一对特异性引物,通过RT-PCR扩增293FT细胞mRNA,获得PARP10cDNA。将获得的cDNA克隆到pCMV-Myc和pEGFP-C1中,用免疫沉淀和激光共聚焦实验验证了PARP10和β-actin存在相互作用。然后,通过RT-PCR法发现该基因在小鼠体内表达的组织分布,组织表达谱显示该蛋白在各组织中均有表达;Westernblotting分析表明,UV造成的细胞损伤能够引起PARP10表达水平的增高。PARP10组织表达谱的确定,与β-actin相互作用的验证以及对UV的应激反应都为进一步研究PARP10的生物学功能奠定了基础。     

parp10基因RNA干扰有效靶点的筛选及验证

目的：合成并筛选有效抑制parp10表达的siRNA。方法：根据parp10 cDNA序列,设计并合成prap10基因潜在的RNA干扰（RNAi）片段,将合成的寡核苷酸序列构建到pEGFP-C1H1U6载体中;通过双萤光素酶试验、Western blotting筛选有效的干扰序列;进一步用G418对A549细胞进行耐受度筛选,确定最低耐受度;用G418溶液对转染RNAi重组质粒的A549细胞进行筛选,通过RT-PCR鉴定干扰效果。结果：针对617bp处所构建的RNAi载体能够抑制PARP10的表达,用浓度为400μg/mL G418的McCoy′s 5A培养基筛选转染后的细胞,获得了能够表达绿色荧光标签蛋白的A549细胞株,经RT-PCR检测发现,PARP10表达受到抑制。结论：获得了能够有效抑制PARP10表达的特异性小干扰RNA（siRNA）,为进一步研究其生物学功能提供了条件。     

H5N1亚型高致病性禽流感病毒NS1基因的克隆及其序列分析

目的：克隆H5N1亚型禽流感病毒的NS1基因,并分析其序列特性。方法：通过RT-PCR方法克隆H5N1亚型禽流感病毒NS1基因,并对该基因片段进行测序,将此序列与数据库中不同时间、地点、宿主来源的H5N1亚型流感毒株NS1基因序列进行同源性比较。结果：获得了678bp的NS1全长基因,可编码225个氨基酸;其与毒株A／chicken／Jilin／hq／2003的同源性最高,二者的核酸和氨基酸的同源性分别为99．7％和99．1％。比对分析发现,该毒株NS1基因在第238-252位有15个核苷酸的缺失;进化树分析表明,它与1997年香港流行的H5N1亚型禽流感病毒毒株分别属于2个不同的分支。结论：克隆了一株H5N1亚型禽流感病毒的NS1基因,并初步分析了其序列特性,为进一步研究NS1基因的功能奠定了基础。