含HVT部分gB基因马立克氏病病毒的转移载体的构建及表达

根据已发表马立克氏病病毒(MDV)血清Ⅰ型短独特区(US)基因序列,设计一对引物用PCR方法扩增出CVI988/Rispens株的包括部分sorf2和sorf3基因及全部us1和us10基因,并克隆入SK(+)载体中,筛选出阳性载体pBUS10.用PCR的方法在火鸡疱疹病毒(HVT)gB基因主要抗原决定簇的前端及后端分别加上血凝素基因(HA)及终止子TAA,并克隆到pcDNA3 载体中,构建出在CMV启动子和增强子控制下含HA及gB基因主要决定簇的表达盒;将此表达盒克隆入pBUS10载体的us10基因中,构建出一种含HA及gB基因主要决定簇的转移载体pBUS10gB3.转染CHO细胞后,用兔抗鸡IgY进行间接免疫荧光试验,证实该转移质粒载体可有效地表达HVT gB基因.     

PMWS病猪猪圆环病毒2型全基因组序列分析

根据GenBank中发表的猪圆环病毒2型(PCV2)全基因序列,设计一对特异性引物,用PCR方法直接从5省病料中分别扩增出5个PCV2毒株的全基因组,分别命名为FujianPCV、GuangxiPCV、HainanPCV、HunanPCV和ShandongPCV.将扩增片段克隆于pMD 18-T载体,进行序列测定,结果表明,除FujianPCV株核苷酸长度为1768bp,其余四株均为1767 bp.应用DNAstar序列分析软件分析表明,本实验的5个PCV2分离株与世界上其它地区的PCV2分离株密切相关,核苷酸序列同源性达93%～98.8%,与PCV1毒株的序列同源性只有68.4%～70%.其中ORF1和ORF2所编码的氨基酸序列与国内外PCV2毒株比较,同源性也很高,分别为98.1%～99.4%和88%～99.1%.     

猪链球菌荚膜多糖合成相关基因簇保守区的克隆与分析

【目的】为了解猪链球菌各血清型荚膜多糖合成相关基因保守区的功能与基因进化关系,【方法】在分析已知的猪链球菌1、2、7、9型荚膜多糖合成相关基因簇序列,及其各orf与猪链球菌33个血清型基因组DNA杂交结果的基础上,提出猪链球菌荚膜多糖合成相关基因簇具有与肺炎链球菌相似的盒样结构的假设。并采用PCR、测序和Southern印迹杂交等方法验证这些假设。【结果】结果显示,猪链球菌的荚膜多糖合成相关基因簇确存在与肺炎链球菌相似的盒样结构,5’端的前4个调节相关基因同源性极高,基因簇两端都有保守的侧翼基因,且在3’端的侧翼序列中找到了适于扩增荚膜多糖合成相关基因簇中血清型特异性区域的下游引物所在基因(aroA)。分析发现,各血清型的orfY、orfX、cpsA、cpsB、cpsC、cpsD和aroA的亲缘关系较近。     

细菌荚膜多糖

随着分子生物学、糖化学和免疫学的发展,细菌荚膜多糖的研究逐步深入.不仅对其特性及组成有了进一步的了解,而且对其多糖合成相关基因、合成调节和致病性进行了更为细致的研究.本文概括了细菌荚膜多糖的化学结构、合成相关基因、多样性产生机制、合成调节、功能与致病性和应用前景,总结其研究热点,以期为荚膜多糖的研究和应用提供理论依据和思路.     

猪细小病毒SD-68株vp2基因的克隆及序列分析

对猪细小病毒(PPV)SD-68株vp2基因进行的克隆和序列测定表明SD-68株VP2基因全长1740bp,编码579个氨基酸残基组成的多肽;PPV SD-68株与Kresse株、SY-99株、NADL-2(5075)株、NADL-2(4973)株、US-1株的VP2基因比较,核苷酸的同源性在99%以上,氨基酸的同源性在96%以上.进化树分析表明SD-68株与kresse株的亲缘关系最近;在决定毒株组织嗜性的关键氨基酸位点上(378,383及436),SD-68株与kresse株的差异最小,据此推测SD-68株的组织嗜性与Kresse株相似,即SD-68株属皮炎型PPV;而比较弱毒株NADL-2、SD-68和强毒株kresse VP2的氨基酸差异后发现,215、378和383可能是决定PPV致病性强弱的关键位点.     

耻垢分枝杆菌EF-G敲低菌株的构建和耐药分析北大核心CSCD

GTPase延伸因子G(elongation factor G,EF-G)是蛋白质翻译过程中重要的翻译因子。作为唯一在翻译延伸和核糖体再生2个翻译环节发挥重要功能的翻译因子,EF-G成为潜在的抗菌药物作用靶点。耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmetics,Msm)和结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)基因组中均存在2个EF-G同源编码基因,分别为Msm EFG1(MSMEG_1400)和Msm EFG2(MSMEG_6535),fusA1(Rv0684)和fusA2(Rv0120c)。基因突变库和生物信息学推测Msm EFG1(MSMEG_1400)和fusA1(Rv0684)是生长必需基因。为探究分枝杆菌中EF-G的生物学功能及特点,利用成簇的规律间隔的短回文重复序列干扰(clustered regularly interspaced short palindromic repeats interference,CRISPRi)技术构建了耻垢分枝杆菌中2个EF-G诱导型敲低菌株(Msm-ΔEFG1(KD)和Msm-ΔEFG2(KD)),研究发现EF-G2的敲低对细菌生长无影响,而EF-G1的敲低显著影响分枝杆菌的生长,成膜能力显著减弱、菌落形态显著变化、菌体长度显著增长,推测EF-G可能与细菌的分裂相关。最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)实验结果表明,抑制EF-G1的表达可增强分枝杆菌对利福平、异烟肼、红霉素、夫西地酸、卷曲霉素等抗菌药物的敏感性,提示EF-G1可能成为未来抗结核药物筛选的潜在靶标,为探究EF-G在分枝杆菌中的生理功能及作为潜在药物靶标提供基础。     

猪细小病毒SD-68株NS1基因的克隆与序列分析

对猪细小病毒(PPV)SD-68株NS1基因进行了克隆和序列测定,结果表明SD-68株NS1基因全长1989bp,编码662个氨基酸组成的多肽.该序列与PPV SY-99株、Kresse株、NADL-2(5075)和NADL-2(4973)株的NS1基因比较,核苷酸的同源性分别为99.9%、99.9%、99.7%、98.1%,氨基酸的同源性分别为99.7%、99.5%、99.5%、96.7%.PPV SD-68株与MVM(i)、MEV(Abashiri)、CPV、FPV、BPV3、GPV NS1的进化树分析表明PPV SD-68株NS1与MVM(i)NS1亲缘关系最近,与BPV3 NS1的亲缘关系最远;在Thr435和Ser473位点PPV SD-68株与MVM(i)完全一致,表明Thr435和Ser473是PPV SD-68株NS1潜在的磷酸化位点.     

A型猪流感病毒山东分离株鉴定及其HA基因序列分析

从山东各地疑似流感发病猪分离到10株流感病毒,经国家流感中心鉴定均为A型流感病毒H9N2亚型.将其中一株Sw/SD/1/2003(H9N2)的血凝素全基因(HA)进行克隆与测序,与GenBank收录的其它猪流感和禽流感H9N2 亚型的HA基因进行比较,发现Sw/SD/1/2003(H9N2)的血凝素基因在核苷酸序列方面同广西1999年分离的禽流感毒株Ck/GX/99(H9N2)和2000年云南分离的禽流感毒株Ck/YN/2000(H9N2)的同源性最高;进化树分析表明Sw/SD/1/2003 (H9N2) 起源于禽源的H9N2亚型流感病毒;Sw/SD/1/2003 的HA氨基酸裂解位点与其他H9N2亚型不同,Sw/SD/1/2003 的HA氨基酸裂解位点是R-S-L-R-G, 而其它猪流感和禽流感H9N2亚型都是R-S-S-R-G.     

猪伪狂犬病毒鲁A株TK基因的序列测定及其结构功能与进化分析

对猪伪狂犬病毒鲁A株(PRV LA株)TK基因进行了克隆和序列测定,并分析比较了该序列与PRV NIA-3株、Ea株、SH以及HSV-1和VZV的同源性,结果表明:在全长1048bp的DNA序列中,包括着一个963bp的开放阅读框(ORF),可编码320个氯基酸组成的多肽;在整个TK基因的ORF内,PRV LA株与PRV NIA-3株、PRV Ea株、PRV SH株、HSV-1、VZV的TK基因比较,核苷酸的同源性分别为98.9%、99.5%、99.3%、36.4%、39.1%,氨基酸的同源性分别为98.4%、99.7%、98.7%、36.6%、37.2%.PRV LA株TK具有疱疹病毒胸苷激酶催化结构域的保守氨基酸共有序列和亚结构域特征序列.将PRV-LA TK、人类和小鼠的胸苷酸激酶、人类脱氧胞苷激酶、人类腺苷酸激酶的对应于这两个亚结构域的氨基酸用DNA Star分析的进化树表明,疱疹病毒的TK与人类和小鼠的胸苷酸激酶的亲缘关系比与人类脱氧胞嘧啶激酶的亲缘关系更近,因此疱疹病毒的TK基因在进化上可能起源于宿主细胞的胸苷酸激酶基因.     

表达绿色荧光蛋白的重组CVI988病毒的构建及特性

提取马立克氏病毒I型疫苗毒株CVI988的总DNA为模板,利用PCR技术扩增出病毒生长非必需的US2基因并克隆入T-easy载体.将CMV启动子和增强子控制的含GFP基因表达盒克隆入US2基因中,成功构建了含GFP基因的转移质粒载体pGUS2GFP.用脂质体将其与CVI988 株共转染CEF细胞,用96孔板稀释法得到纯化的表达绿色荧光蛋白的重组CVI988病毒株rCVIGFP,并分别测定其在体内和体外的生长情况.表达EGFP基因的重组病毒在细胞上生长曲线与亲本毒CVI988类似,体外实验表明,1日龄腹腔接种该重组毒后,可以从鸡体内分离到表达绿色荧光的病毒.