不同品种猪HSL基因5'-UTR和外显子Ⅰ片段的克隆测序及多态性分析

激素敏感脂肪酶(Hormone-sensitive lipase,HSL)是负责分解脂肪组织中甘油三酯释放游离脂肪酸的关键和限速酶,也是影响动物脂肪沉积的关键酶.将HSL基因作为影响猪脂肪代谢和沉积相关性状的候选基因,对不同品种猪HSL基因5’-UTR和外显子Ⅰ片段进行了克隆测序并开展多态性与性状间的关系研究.序列比较发现,在测定的HSL基因靠近起始密码子(ATG)的419 bp中,杜洛克、梅山猪、大白猪和平序列完全一致,与长白猪序列比较,在-13～-12 bp位置存在GC→CG的碱基变异;梅山猪(3个体)、通城猪(3个体)、长白猪(3个体)、大白猪(3个体)HSL基因外显子Ⅰ的442 bp位置有G→A碱基间的变异,G→A的转换改变了限制性内切酶BsaHⅠ酶识别位点,且导致了编码氨基酸Val→Ile的替换.经PCR-RFLP分析,HSL基因外显子Ⅰ BsaHⅠ位点多态性有AA、AG和GG 3种基因型.”大白×梅山”F2代资源家系BsaHⅠ点不同基因型个体背膘厚、肌内脂肪等性状协方差统计分析发现,AG基因型和GG基因型在眼肌面积上存在显著差异.     

不同品种猪HSL基因5′-UTR和外显子Ⅰ片段的克隆测序及多态性分析

激素敏感脂肪酶(Hormone sensitivelipase,HSL)是负责分解脂肪组织中甘油三酯释放游离脂肪酸的关键和限速酶,也是影响动物脂肪沉积的关键酶。将HSL基因作为影响猪脂肪代谢和沉积相关性状的候选基因,对不同品种猪HSL基因 5′ UTR和外显子Ⅰ片段进行了克隆测序并开展多态性与性状间的关系研究。序列比较发现,在测定的HSL基因靠近起始密码子(ATG)的 419bp中,杜洛克、梅山猪、大白猪和清平猪序列完全一致,与长白猪序列比较,在-13 ~-12bp位置存在GC→CG的碱基变异;梅山猪(3个体)、通城猪(3个体 )、长白猪 (3个体 )、大白猪(3个体)HSL基因外显子Ⅰ的 442bp位置有G→A碱基间的变异,G→A的转换改变了限制性内切酶BsaHⅠ酶识别位点,且导致了编码氨基酸Val→Ile的替换。经PCR RFLP分析,HSL基因外显子ⅠBsaHⅠ位点多态性有AA、AG和GG 3种基因型。“大白×梅山”F2 代资源家系猪BsaHⅠ位点不同基因型个体背膘厚、肌内脂肪等性状协方差统计分析发现,AG基因型和GG基因型在眼肌面积上存在显著差异。     

合作猪SLA-DQA基因第4外显子多态性分析

合作猪的MHC-DQA基因的适应性变异,其抗原识别区域(即外显子4)通过PCR扩增和随后的单链构象多态性(SSCP)和序列分析,结果显示在439个合作猪个体,SLA-DQA第4外显子检出4个等位基因和6个基因型(AA、BB、DD、AB、AC和AD),其中A等位基因和AA基因型的频率最高,为优势基因和优势基因型。对不同型的PCR-SSCP条带测序分析,发现7个突变位点(5 068 bp T→C,5 109 bp和5 149 bp处缺失C,5 131 bp A→G导致丝氨酸变为甘氨酸,5 135 bp C→T,5 234 bp G→A,5 136 bp处插入A)。遗传学分析发现,合作猪多态信息含量(PIC)为0.240 1,属于低度多态,各种基因型的分布不显著。研究结果证实,合作猪SLA—DQA基因第4外显子为低度多态。     

鳜鱼胰蛋白酶和淀粉酶与胃蛋白酶原基因的克隆与序列分析

采用RT-PCR及RACE法,克隆得到鳜鱼(Siniperca chuatsi)肝胰脏胰蛋白酶(trypsin, Try)、淀粉酶(amylase, Amy)基因 cDNA全序列.结果表明,鳜鱼Try基因cDNA全长为896 bp,其中开放阅读框 (open reading frame,ORF)为744 bp,编码247个氨基酸. 序列同源性分析发现,鳜鱼Try与 斑马鱼(Danio rerio)、非洲爪蟾(Xenopus laevis)、 小鼠Try和人TRY氨基酸序列同源性分别为81.4%、75.3%、74.5%和71.4%.鳜鱼Amy 基因cDNA全长为1 647 bp,其中ORF为1 539 bp,编码512个氨基酸.鳜鱼Amy与斑马鱼 、非洲爪蟾、小鼠Amy和人AMY氨基酸序列同源性分别为79.7%、75.4%、71.9%和70.9%. 同时对鳜鱼基因组进行PCR,获得鳜鱼Try、Amy与胃蛋白酶原(pepsinogen, Pep)全基因组DNA序列.序列分析表明,鳜鱼Try基因由4个内含子和5个外显子组成,全长1 362 bp;鳜鱼Amy基因由8个内含子和9个外显子组成,全长4 267 bp;鳜鱼Pep基因由8个内含子和9个外显子组成,全长 4 032 bp,与其它脊椎动物基因结构相似.应用Genome walker方法在鳜鱼克隆得到长度分别为1 189 bp、413 bp和527 bp的Try、Amy和Pep基因的5′侧翼区序列以及1段长为704 bp的Pep 基因3′侧翼区序列,并利用相关软件预测其中具有多个可调节其表达的调控元件.鳜鱼Try、Am y和Pep基因组全序列的克隆及其序列、结构分析和分子系统进化等的研究,为鱼类消化代谢相关基因的生理功能及表达调控机理进一步研究提供依据.     

人类新基因C17orf32的电子克隆和编码区序列RT-PCR验证

利用生物信息学与实验验证的技术路线,成功地克隆了人类新基因C17orf32的cDNA(GenBank登记号：AY074907和TPA: BK000260),发现C17orf32的完整开放阅读框架(ORF,31～657 bp）cDNA（627 bp）与人类假定基因LOC124919 ORF(25～807 bp)的25～651位只有一个碱基不同.经RT-PCR验证并cDNA测序、人类表达序列标签(EST)数据库的BLAST检索和基因组成规律分析三方面的结果,均支持C17orf32的序列,而不支持LOC124919的编码序列.C17orf32基因组序列全长4.610 kb,含有6个外显子和5个内含子,cDNA序列全长1 679 bp, ORF横跨全部6个外显子.该基因ORF翻译起始处符合Kozak规则,ORF起始码上游同一相位有终止码,ORF后有2个加尾信号和PolyA尾.C17orf32基因的成功克隆表明,NCBI GENOME Annotation Project在2001年12月预测的人类假定蛋白XP-058865编码基因LOC124919的模式参考序列XM-058865中存在偏差,即在C17orf32基因cDNA的406与407位碱基之间错误插入一个碱基G, 从而导致在插入位点后,ORF编码125位氨基酸以后蛋白质序列的改变,出现260个氨基酸的多肽.因此,应慎重看待计算机注释的人类基因组编码序列.建立的技术路线有助于发现更多新的人类功能基因.     

棉花nodulin-like基因及其启动子的结构特征和遗传表达

用同尾酶反向PCR技术(Ⅱ-PCR)和快速分离目的基因cDNA 5'未知序列方法(RICUP)首次从陆地棉品种Y18(Gossypium arboreum L.Y18)中分离到nodulin-like基因的全长cDNA、DNA和启动子序列.结果表明,该基因全长为2 353 bp,具有5个内含子和6个外显子.cDNA全长1480 bp,含有一个1125 bp的ORF结构,编码375个氨基酸,在GenBank nr数据库中没有与之同源的基因序列,在EST数据库中仅有一条733 bp的亚洲棉纤维EST序列(GenBank登录号:BF271235)与之有92%的同源性.Nodulin-like基因的启动子全长1 969 bp,启动子区域具有Initiator、TATA box、CAAT-like box和富含AT序列等启动子特征序列.Southern blot结果表明:该基因在棉花基因组中有一个拷贝.Northern blot结果表明:该基因在棉花的蕾、花、纤维和铃壳等生殖器官中呈优势表达.本研究有望为改良棉花生殖器官的农艺性状提供靶基因,并为解决目前转基因抗虫棉"前期抗虫性强、后期抗虫性弱"这一生产实际问题提供有效的表达调控元件.     

猪STCH基因的Bi-PASA遗传标记及多态性研究

微粒体应激 70蛋白三磷酸腺苷酶 (STCH)基因属于应激 70蛋白基因伴侣家族 ,在机体免疫反应和疾病抵抗力等方面起重要作用。根据人和小鼠STCH基因的保守序列设计引物 ,PCR扩增到猪STCH基因第5外显子 4 4 5bp片段。序列测定显示 ,猪STCH基因与人和小鼠STCH基因分别具有 87 13%和 80 4 5 %的同源性。通过测定和比较中国梅山猪、欧洲约克夏猪及PIC商品猪的STCH基因序列 ,发现在猪STCH基因编码区第 5外显子 10 5 0位点上存在一个单碱基突变位点。利用双向特定等位基因PCR扩增法 (Bi PASA)建立了检测猪STCH基因变异的遗传标记 ,并用该标记分析了STCH基因在中国家猪 (梅山猪、荣昌猪和金华猪 )、欧洲家猪 (约克夏猪、大白猪 )、商品猪 (PIC合成系 )以及欧洲野猪的基因频率和多态性。本研究建立的Bi PASA遗传标记和基因变异信息 ,将为进一步分析猪STCH基因变异与经济性状的相关分析提供基础资料。     

一个巴西橡胶树钙调素基因假基因的识别

以巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)基因组DNA为模板,根据胶乳钙调素基因HbCaM序列设计引物,利用PCR方法克隆获得了1 319 bp和447 bp的两个DNA片段.序列分析表明,1 319 bp的DNA长片段为胶乳钙调素基因HbCaM的DNA片段,含有两个外显子(77 bp和373 bp)和1个内含子(869 bp),包含了HbCaM cDNA编码区447 bp的全部序列;447 bp的DNA小片段与HbCaM cDNA核苷酸序列同源性高达98%,ORF分析发现,位于406?bp处的碱基C突变为T,即三联体密码CAG突变为终止子TAG使翻译提前终止,其余5个差异碱基都不影响或改变正常的翻译.推测此447 bp的DNA片段为巴西橡胶树钙调素HbCaM基因的假基因,命名为HbCaMP1.     

大熊猫和亚洲黑熊TNNC1 基因的克隆、表达与序列分析

慢肌肌钙蛋白C (Troponin C type 1,TNNC1)具有高度保守性,调控骨骼肌慢肌和心肌的收缩,影响肌蛋白的生成,从而可能导致动物肌肉的生长、进化和功能的差异。本研究以大熊猫和亚洲黑熊骨骼肌为材料,提取总RNA 和基因组DNA,运用RT-PCR 和Touch-down PCR 分别扩增出TNNC1 基因的cDNA 序列和结构基因序列,并且构建了含有TNNC1 cDNA 的重组表达载体,转化进入E. coli BL21 进行超表达研究。结果表明大熊猫TNNC1 基因的cDNA 片段长602 bp,包含一个编码161 个氨基酸的开放阅读框,其结构基因全长2 831 bp,包含6 个外显子和5 个内含子。亚洲黑熊TNNC1 基因的cDNA 片段长486 bp,亦包含一个编码161 个氨基酸的开放阅读框,其结构基因全长2 758 bp,同样包含6 个外显子和5 个内含子。该两个物种的TNNC1 基因与已报道的13种动物的TNNC1 基因具有很高的相似性。拓扑预测表明,大熊猫和亚洲黑熊TNNC1 蛋白有1 个蛋白激酶C 磷酸化位点,5 个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,1 个N-豆蔻酰化位点,3 个EF 手性钙结合域及1 个N - 糖基化位点。将TNNC1 基因在大肠杆菌中表达发现TNNC1 蛋白与氮端多聚组氨酸标签蛋白(His6) 融合成大小为23. 5kD 左右的多肽,这与预期结果相一致。本研究结果为进一步深入探讨大熊猫和亚洲黑熊TNNC1 基因及蛋白的结构、功能和进化关系提供资料。     

长春花钙调素基因克隆及其假基因的识别

以长春花[Catharanthus roseus(L.)G.Don]叶片cDNA和基因组DNA为模板,利用PCR技术扩增得到了长春花钙调素基因447 bp的全长编码cDNA序列和2个大小不同的DNA片段.序列分析表明,DNA长片段全长1 551 bp,由2个外显子和1个内含子构成,为长春花钙调素基因编码区DNA片段;DNA小片段全长447 bp,与447 bp的长春花钙调素基因cDNA核苷酸一致性高达87%,有56个碱基的差异,其中位于226 bp处的碱基A突变为T,即由AAG突变为终止密码子TAG使翻译提前终止.推测此447 bp的DNA小片段可能为长春花钙调素基因的假基因,命名为CCaMP1.     

猪ACTA2基因的克隆、表达分析及其与生产性状的关联

为鉴定对猪生产性状有重要影响的新分子标记,文章采用电子克隆结合PCR方法获得了猪肌动蛋白α2(Actin alpha 2, ACTA2)基因编码区序列和部分基因组序列,建立了第2内含子C1554T替换的PCR-HinfⅠ- RFLP基因分型方法,在所检测的7个不同猪群中除大白和梅大群体外,其他群体中均是C等位基因频率高于T等位基因的频率。标记与性状关联分析发现ACTA2基因型与肩部背膘厚、臀部背膘厚、肥肉率、瘦肉率、股二头肌pH和肌内脂肪显著或极显著相关,TT基因型与CC基因型相比具有更高的瘦肉率以及更低的肥肉率和背膘厚。通过Real-time RT-PCR分析发现ACTA2在大白和梅山两个品种猪骨骼肌中的表达量都随着日龄的增加而降低,在各个阶段,梅山猪中的表达量都比大白猪中的表达量高。     

五指山猪IGF2基因5′调控区单核苷酸多态性分析

利用PCR产物直接测序法, 对五指山猪、滇南小耳猪、香猪、梅山猪和大白猪共60个样本的IGF2基因5＇调控区部分片段的单核苷酸多态性进行了研究。找到13个SNP, 分别是: C5872T、C5888T、A5976G、C6010T、T6029A、C6037T、C6043T、C6063T、C6112T、C6164T、G13520A、G13563A和G13669A。T6029A为T←→A碱基颠换, A5976G、G13520A、G13563A和G13669A为A←→G转换, 其他均为C←→T转换。针对13个SNP位点得到23种组合基因型。统计各位点等位基因和基因型以及各组合基因型在总群体与各品种内的分布频率, 发现3个小型猪在A5976G、C6164T和G13669A位点上的优势等位基因均分别为G、T和A, 而梅山猪和大白猪的优势等位基因均分别为A、C和G; H19型为3个小型猪的特征组合基因型, 而另两个猪品种为H15型。同时对123头五指山猪IGF2基因C5888T位点进行了PCR-RFLP分析, 研究表明该位点C为优势等位基因(0.8536), CC为优势基因型(0.7235)。卡方检验表明该位点处于Hardy-Weinberg平衡状态。这些结果可为五指山猪等小型猪的生长发育规律、矮小机制等方面的研究提供遗传学依据。     

Cloning, mapping and association study with carcass traits of the porcine SDHD gene

A 1320-bp cDNA containing the full coding region of the porcine succinate dehydrogenase complex, subunit D (SDHD) gene was obtained by random sequencing of clones from a Chinese Tongcheng pig 55-day fetal longissimus dorsi muscle cDNA library. Analysis of the SDHD gene across the INRA-University of Minnesota porcine radiation hybrid panel indicated close linkage with microsatellite marker SW2401, located on SSC9p21. The open reading frame of this cDNA covers 480 bp and encodes 159 amino acids. The deduced porcine amino acid sequence showed greater similarity with human and bovine protein sequences than with those from mouse and rat. The BLAST analysis of the porcine SDHD to NCBI identified Unigene Cluster Ssc.2586. Possible single nucleotide polymorphisms (SNP) were identified by alignment of expressed sequence tags in the cluster. The polymerase chain reaction (PCR) single strand conformation polymorphism, sequencing, and PCR restriction fragment length polymorphism were used to confirm and detect a synonymous polymorphic MboI site within the open-reading frame. Allele frequencies of this SNP were investigated in two commercial and five Chinese local pig breeds. These five Chinese breeds had very high frequencies for one allele, whereas frequencies of both alleles were intermediate in Large White and Duroc. An association analysis suggested that different SDHD genotypes have significant differences in loin-muscle area (P < 0.01).     

Molecular cloning,polymorphism and association analyses of a novel porcine mRNA differentially expressed in the Longissimus muscle tissues from Meishan and Large White pigs

The mRNA differential display technique was performed to investigate the differences of gene expression in the longissimus muscle tissues from Meishan and Large White pigs. One novel mRNA that was differentially expressed was identified through semi-quantitative RT-PCR and the cDNA complete sequence was then obtained using the rapid amplification of cDNA ends (RACE) method. The nucleotide sequence of the mRNA is not homologous to any of the known porcine genes. Sequence prediction analysis revealed that the this mRNA is not protein-coding mRNA. Polymorphism analyses revealed that there was a C-T mutation on the position of 669 bp and PCR -Dra I-RFLP analyses revealed that Chinese indigenous pig breeds and exotic pig breeds displayed obvious genotype and allele frequency differences at this locus. Association analyses revealed that this polymorphic locus was significantly associated with the drip loss rate, skin percentage, meat color value (m.Longissimus Dorsi, LD), loin eye width, loin eye area, water holding capacity, carcass length, caul fat weight, intramuscular fat (m.Longissimus Dorsi, LD), lean meat weight, lean meat percentage, backfat thickness at buttock (P < 0.05).     

Imprinting analysis of porcine <Emphasis Type="Italic">DIO3</Emphasis> gene in two fetal stages and association analysis with carcass and meat quality traits

Imprinted genes play important roles in mammalian growth, development and behavior. In this study, we obtained 1568 bp mRNA sequence of porcine DIO3 (deiodinase, iodothyronine, type III), and also identified its imprinting status during porcine fetal development. The complete open reading frame (ORF) encoding 278 amino acids. The porcine DIO3 mRNA was expressed predominantly in backfat, mildly in liver, uterus, kidney, heart, small intestine, muscle and stomach, and almost absent in spleen and lung. A single nucleotide polymorphism in exon (A/C ⁶⁸⁷) was used to investigate the allele frequencies in different pig breeds and the imprinting status in porcine embryonic tissues. The results indicate that DIO3 was imprinted in all the tested tissues. Statistical analysis showed the DIO3 gene polymorphism was significantly associated with almost all the fat deposition and carcass traits, including lean meat percentage (LMP), fat meat percentage (FMP), ratio of lean to fat (RLF), shoulder fat thickness (SFT), sixth–seventh rib fat thickness (RFT), buttock fat thickness (BFT), loin eye area (LEA), and intramuscular fat (IMF).