人红细胞生成素基因在小鼠体内的转移与表达

将人的红细胞生成素(EPO)基因克隆在CMV启动子的下游,构建EPO表达质粒,在BHK₂₁细胞中表达成功后,将该质粒经脂质体包埋,再导入到小鼠的骨骼肌内,在体内亦获得了表达,一个月时小鼠血浆中人红细胞生成素的表达量高达1 340 ng/L,这为贫血病人的基因治疗提供了科学依据.     

促红细胞生成素在低氧预适应中的神经保护作用

促红细胞生成素(EPO)是体内一种重要的糖蛋白激素,主要由胎肝和成人的肾脏产生。EPO的表达除受到转录因子的调控之外,还受到表观遗传学的调控。研究发现,EPO及其受体(EPOR)在中枢神经系统中广泛表达,提示其对中枢系统具有神经保护作用。低氧预适应是机体抗缺氧或缺血的一种内源性保护机制,它可以促进EPO表达,减轻低氧/缺血引起的神经元损伤。EPO主要通过激活一系列信号转导通路及多种可能的机制发挥神经保护作用。     

转EPO基因成肌细胞移植治疗大鼠肾性贫血的实验研究

以产病毒包装细胞上清转染原代培养的大鼠骨骼肌成肌细胞和皮肤成纤维细胞 ,经G41 8筛选得到转染成功的阳性克隆 ,分别命名为Myo/EPO和Fib/EPO .将抗性克隆扩增并测定培养上清中EPO活性 ,供大鼠移植 .肾性贫血大鼠经乙醚麻醉后 ,通过多点肌注及皮下注射分别将Myo/EPO和Fib/EPO植入大鼠体内 ,动态检测各组大鼠外周血象 ,定期测定大鼠血清EPO含量及移植部位肌组织hEPO分泌情况 .结果表明 ,对照组 (Myo/X)大鼠血红蛋白 (Hb)和红细胞压积 (HCT)进行性降低 ,而治疗组大鼠 (Myo/EPO)的Hb和HCT在移植后 1 4d ,由移植前的 ( 92 .5± 3.0 )g/L和 0 .2 9± 0 .0 4升至 ( 1 0 3.8± 5 .0 ) g/L和 0 .32± 0 .0 4,之后逐渐下降 ,但仍高于或维持移植前水平达 90d ,Fib/EPO细胞移植的作用特点与Myo/EPO组类似 ;Myo/EPO细胞移植前大鼠血清EPO的浓度已测不出 ,移植后 30 ,6 0 d测得EPO的浓度分别为 ( 4.2± 1 .3)、( 3.3± 0 .9)mU/mL ;以PCR和免疫组化方法对移植后 6 0d大鼠肌注部位的肌肉组织进行检测证实 ,移植部位肌组织存在hEPOcDNA ,并且分泌EPO蛋白 .结论 :以大鼠骨骼肌成肌细胞作为EPO基因治疗的靶细胞进行大鼠体内移植 ,可以较持久地改善大鼠肾性贫血症状 ,具有潜在的应用价值 ,为临床上EPO基因治疗提供了实验依据     

稳定表达促红细胞生或素的重组腺病毒的构建及其对大鼠的促红细胞生成作用

用EPO基因组基因构建了腺病毒质粒型载体psp1B/hEPO,该质粒含有以RSV-LTR为启动子的完整的EPO基因表达盒.单独转染CHO细胞,经暂态表达检测到EPO的表达。用psp1B/hEPO与腺病毒拯救型载体pBHG11共转染293细胞,获得了表达EPO的重组腺病毒AdhEPO.经Southern杂交证实AdhEPO中有EPO表达盒,ELISA检测到了EPO阳性表达.用5×108pfu的AdhEPO给大鼠作一次性肌肉注射,观察到了其促进大鼠红细胞生成的短期效应。在注射后第1,3,5,7,10d分别检测了大鼠的红细胞压积、血红蛋白含量和红细胞计数等指标,发现大鼠的红细胞数量显著提高。在第10d红细胞压积从46±4%上升至65±6%。证实了重组腺病毒AdhEPO具有潜在的临床应用价值,可用于贫血症的基因治疗。     

质粒治疗肢体动脉闭塞性疾病的安全性分析

肢体动脉血管闭塞性病是一种严重危害人类健康的疾病,许多病人最终要截肢,基因治疗为这类患带来了希望。利用肝细胞生长因子促进血管生成的作用,采用质粒作为载体对大鼠和故事片诉下肢动脉闭塞疾病模型进行治疗,效果良好。为探讨基因治疗的安全性问题,用绿色荧光蛋白报告基因研究质粒在体内的分布和表达,方法简便。通过制作冰冻切片观察绿色荧光蛋白在小鼠体内的表达情况发现局部注射质粒不会造成全身性扩散,表明该方法安全。     

腺病毒相关病毒载体的研究进展

实现基因治疗的关键在于目的基因的高效转移并适度表达,这将直接影响其治疗的效率和安全性。因此,探寻理想的基因转移载体显得尤为重要。腺病毒相关病毒（adeno-associated virus,AAV）是一种缺陷型的单链DNA病毒,既可以转染分裂细胞又可以转染非分裂细胞。AAV在宿主体内以定向整合的方式存在,AAV重组体在细胞内能长期稳定地表达,且在体内不引起明显的病理变化,表明AAV作为基因治疗的载体是安全、有效和可行的。     

脊髓损伤的基因治疗

基因治疗脊髓损伤（SCI）既不存在胎儿神经组织移植的组织来源问题,且比外周神经组织移植引起的排异性低,是目前脊髓损伤治疗中最有前途的方法.基因治疗的转基因方式有两种：一是将目的基因直接导入体内靶细胞令其表达;二是将基因在体外导入适当的细胞内,并筛选出高效表达的移植细胞作为转基因中介移植到体内靶组织.不论采用何种方式,将基因导入细胞又可用多种手段实现：如微注射、脂质体等物理或化学手段;利用缺陷病毒作为载体感染细胞的生物学手段.因为用生物学手段转基因的细胞移植方法空间定位明确,所以目前最常采用它作为基因治疗效果的研究.虽然SCI基因治疗目前仍停留在实验探索阶段,一些问题尚待解决,但随着基因治疗技术方法的不断提高,它的临床应用前景可以预见.     

皮肤细胞在基因治疗中的应用

自1990年美国国立卫生研究院首次批准基因治疗方案以来,该领域发展迅速,研究涉及的范围由单基因缺陷的遗传病扩展到了肿瘤、心血管病,爱滋病及结统组织病等。基因治疗是将目的基因转入病人体内并使其有效地表达,在DNA水平上纠正缺陷。目前广泛采用的方法是将正常基因转入病变细胞或其它靶细胞,使其随机整合到细胞基因组的非特异部位并表达,虽未消除病变基因但能够代偿该基因的功能。     

红细胞生成素受体研究进展

红细胞生成素受体是促红细胞生成素的作用受体 ,属于细胞因子超家族的成员。近年来 ,由于其克隆表达技术的应用使人们在对造血机制、EPO的信号转导机制 ,及利用其受体筛选 EPO类似物方面的研究有了新的进展。本文综合近年来有关文献对 EPO受体的研究作一概括性介绍。     

肿瘤基因治疗方案

自基因治疗遗传病成功以来,人们也尝试着用此方法治疗肿瘤。针对肿瘤发生的多种假设有多种基因治疗方案。本文就此进行综述。1 表达细胞因子的肿瘤细胞疗法 这基本上是一种肿瘤细胞免疫。许多实验室的动物实验表明:经基因修饰后分泌细胞因子的肿瘤细胞可以在宿主体内产生显著的T细胞反应。 在免疫应答过程中,抗原被辅佐细胞(包括巨噬细胞、树突状细胞、并指状细胞和郎罕氏细胞)所摄取,经     

基于四环素调控系统的病毒载体在基因治疗中的应用

基因治疗已经发展成为处理各种疾病的理想治疗模式.病毒载体是将基因递送到体内或体外的分裂和非分裂细胞的有效工具.病毒载体基因治疗在临床环境成功应用的一个重要问题是严谨和持续地调控基因表达.目前,已经报道的无毒且严谨的调控转基因表达系统中,四环素转录调控系统是在体内和体外研究最好而且高效的调控系统.Tet调控系统已经被编码在慢病毒属、腺病毒属、腺相关病毒属和逆转录病毒属,而且可以有效地对基因进行调控.将主要讨论已经在Tet调控系统调控下递送基因的主要载体系统及其在基因治疗上的应用.     

人类疾病的基因治疗研究进展

<正>基因治疗(gene therapy)是指插入一个正常的或经过修饰的基因到病人体内,通过体内合成丢失的或不足的基因产物来纠正遗传的或获得性疾病的一种方法。它是基因工程技术的一大突破,有着十分广阔的应用前景。1992年10月12日-10月14日,在北京召开了“人基因治疗”为题的国际学术讨论会,本文将此次大会涉及到人类疾病的基因治疗方面的文章作一综述。     

血小板、红细胞生成素双功能融合蛋白的构建

为探索TPO- EPO融合蛋白在肿瘤化疗中作为辅助治疗药物 ,同时纠正红细胞贫血和血小板减少症的可能性 ,首先通过PCR分别扩增了TPON -端 1 5 3肽和EPO成熟肽的编码cDNA ,并构建成功TPO -EPO融合基因 .融合基因在COS- 7细胞和CHO细胞中的表达产物能够维持TPO依赖株Ba/F3 mpl细胞和EPO依赖株Bet -2细胞的生长 ,能够在半固体培养体系中刺激巨核系集落和红系集落的形成 ,表明它同时具有TPO和EPO的生物活性 .初步体内实验表明 ,含有融合蛋白的培养上清可以使小鼠血小板数目升高 40 % ,对红细胞的作用有待进一步确定 .以上结果初步表明融合蛋白构建成功 ,为进一步探讨融合蛋白的体内活性和应用前景打下了基础 .     

用于基因治疗的病毒载体

近几年来,基因治疗研究发展迅速,目的是将外源基因导入靶细胞,在体内产生疗效。早在１９９０年美国ＮＩＨ的研究人员就将腺苷脱氢酶（ａｄｅｎｏｓｉｎｅｄｅａｍｉｎａｓｅ,ＡＤＡ）基因导入病人的淋巴细胞,改善了由于ＡＤＡ基因缺损造成的免疫缺陷［１,２］。基因...     

目的基因表达调控研究进展

载体技术的发展使基因治疗中的安全性问题及外源基因的转移效率等技术难题已部分解决,越来越多的研究显示目的基因体内表达的可控性是决定基因治疗成功的关键,组织特异性启动子,诱导性调控元件,增强子,静息子及反式作用因子作用机制的阐明为改造,增强基因治疗载体表达特性,实现人类基因治疗目的基因表达的可控性,靶向性目标,为基因治疗真正进入临床奠定了基础。     

肝细胞生长因子的分子生物学研究

肝细胞生长因子 (HGF)是一种多功能细胞因子 ,其分子为异二聚体糖蛋白 ,有NK1,NK2 ,NK4三个变种。HGF启动子的结构很复杂 ,其表达受多种因素和调控元件的调节。因HGF在体内有重要作用 ,HGF的基因工程表达和基因治疗正在研究中     

遗传病的基因治疗

基因工程或称重组DNA技术是70年代初发展起来的一门技术,由于它有广阔的理论和应用前景,进展极为迅速,现已广泛应用于药品、农业、工业各方面。在医学方面,基因治疗是人们极为关注的领域,因为人类的遗传疾病有2000种以上,但却没有有效的治疗方法。遗传疾病的根本原因是基因有了缺陷。基因治疗就是在机体中,将有缺陷的基因换上正常的基因,并使之适当表达,或者说,将正常基因插入机体中来纠正遗传缺陷。基因治疗可以分为两类,一是体细胞基因     

促红细胞生成素和受体在前列腺癌组织中共同过表达的研究

目的:探讨促红细胞生成素(EPO)和受体(EPOR)在前列腺癌(PCa)组织中的表达,并进一步阐述EPO和EPOR在前列腺癌发生发展中所起的作用。方法:应用免疫组化SP法检测30例前列腺癌根治术组织标本中癌与增生(BPH)组织的EPO和EPOR表达及30例正常前列腺组织(NP)中的EPO和EPOR表达。前列腺癌分级采用Gleason评分。半定量EPO和EPOR评分分析免疫组化结果。同时根据细胞染色强度区分为过表达和正常表达。统计学分析采用配对样本比较Wilcoxon的秩和检验及线形回归分析。结果:大部分前列腺癌均可见EPO和EPOR同时过表达,但是前列腺增生组织只有EPO过表达;正常前列腺组织没有EPO和EPOR过表达。前列腺癌和良性前列腺增生的EPO免疫组化评分中位数为2.38和0.93(P<0.01);前列腺癌和良性前列腺增生的EPOR免疫组化评分中位数为2.50和0.68(P<0.01)。前列腺增生和前列腺癌的EPO和EPOR表达密切相关,但是前列腺癌的Gleason评分和EPO以及EPOR评分没有相关性(P值均>0.05)。结论:EPO和EPOR同时过表达促进前列腺癌发生发展,但是相对于EPO的过表达,EPOR过表达是前列腺癌发生更为重要的早期事件;前列腺癌组织中EPO和EPOR表达差异,提示除了缺氧外,可能还有其它机制参与EPOR的过表达。     

促红细胞生成素基因修饰的胎肝基质细胞促进脐血CD34 +细胞向红系分化

通过重组慢病毒系统感染人胎肝基质细胞(fetal liver stromal cells,FLSCs),建立了能够稳定高效表达促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)的细胞株EPO/FLSCs.从胎儿肝脏克隆EPO基因,构建重组慢病毒EPO的表达载体,感染FLSCs,根据荧光表达强弱进行流式分选,获得能够继续稳定传代的高表达EPO基因的FLSCs,RT-PCR和ELISA结果证实,细胞株中的EPO基因稳定表达.RT-PCR结果显示,FLSCs的EPO在mRNA水平的表达分别是未转染FLSCs和转染空载体FLSCs的5.63倍和5.71倍.ELISA法检测了转染重组慢病毒EPO表达载体的FLSCs EPO蛋白表达水平,结果显示EPO蛋白的表达水平也明显升高.收集EPO/FLSCs的条件培养基,体外诱导脐血CD34+细胞向造血细胞分化,结果显示向红系定向分化的细胞比例明显居多,有可能为临床细胞治疗提供稳定、高质量的细胞来源.     

以转录因子AP-1为靶的decoy核酸体内外抗肿瘤研究

合成了双链寡聚核苷酸——decoy核酸,其与靶转录因子AP-1有高亲和性,可进入细胞作为decoy顺式元件,通过抑制特异的转录因子和调控区域的结合,调控基因转录而改变基因的表达.在体内外抗肿瘤试验中, decoy核酸有显著抑制肿瘤细胞增殖的作用,可以成为潜在性的肿瘤基因治疗药物.