抗HCMV Pp65蛋白单克隆抗体的制备及性质研究

人类巨细胞病毒（Human cytomegalovirus,HCMV）是一种机会性感染疱疹病毒,在人群中感染比较常见,但在免疫缺陷个体与新生儿中可引起严重的疾病。HCMV Pp65是HCMV活动感染的主要标志,也是临床检验检测HCMV感染的重要靶标。为研发抗HCMV Pp65蛋白单克隆抗体作为临床免疫检测HCMV感染的关键原料,本研究采用重组表达的HCMV Pp65蛋白免疫BALB/c小鼠,将免疫小鼠淋巴结细胞与sp2/0细胞融合,采用间接ELISA法筛选阳性克隆与效价测定,再用Western blotting进行抗体特异性鉴定,最后用免疫捕获PCR和免疫荧光法评价其应用前景。最终获得了1株能稳定分泌高效价的抗HCMV Pp65单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为8D6。Western blotting及间接ELISA检测其效价分别达1∶4 000和1∶105;细胞免疫荧光与免疫捕获PCR实验结果说明,该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体具有良好的亲和力和特异性,具有作为外周血细胞免疫荧光细胞化学和免疫捕获PCR检测HCMV临床感染的关键原料,也可作为双抗体夹心法检测HCMV临床感染的关键原料,为建立HCMV感染快速灵敏的临床诊断试剂打下了重要的基础。     

狂犬病病毒糖蛋白的杆状病毒表达及其免疫原性研究

构建表达狂犬病病毒SRV9株糖蛋白(GP)的重组杆状病毒,评价其表达出的SRV9株糖蛋白对小鼠免疫效果。将狂犬病病毒SRV9株GP基因的完整开放阅读框克隆入穿梭质粒Bacmid中,构建重组穿梭质粒Bacmid-G,以此转染Sf9细胞。对病变细胞培养物进行电镜观察,获得正确重组杆状病毒后,通过Western-blot、IFA及小鼠免疫实验鉴定表达产物的免疫反应性及免疫原性。正确构建重组穿梭质粒Bacmid-G;获得表达SRV9株糖蛋白的重组杆状病毒,其表达产物具有良好免疫原性;表达产物接种小鼠可诱导其产生抗狂犬病病毒中和抗体,中和抗体达到保护水平的比例为100%。本实验所获得的重组杆状病毒表达出的SRV9株糖蛋白具有较好的免疫原性,可诱导小鼠产生保护性中和抗体,该实验为进一步开发狂犬病亚单位疫苗奠定了基础。     

狂犬病病毒M蛋白在杆状病毒中的表达、纯化及多克隆抗体的制备

为表达狂犬病病毒(Rabies Virus,RV)基质蛋白(M)蛋白,进而制备多克隆抗体。本研究以狂犬病病毒BD06株RNA为模版,通过RT-PCR扩增M蛋白基因全序列,将其插入质粒pFastbac I中,获取的重组质粒pFastbac I-M,经酶切鉴定后,转化到DH10Bac E.coli感受态中,以获取重组穿梭质粒Bacmid-M。用lipofectamine2000介导Bacmid-M转染Sf9细胞获取重组杆状病毒AcMNPV-M。用抗His标签的单体、犬抗RV阳性血清及兔抗RV阳性血清通过Western-Blot鉴定重组蛋白的表达及其反应原性。用镍离子亲和层析柱纯化重组蛋白,并免疫新西兰大耳白兔制备多克隆抗体,用Western-Blot和FAVN试验鉴定多克隆抗体的反应原性及其病毒中和效价。结果表明:(1)利用杆状病毒表达系统成功的表达了大小约为25kD的重组M蛋白;(2)重组M蛋白具有良好的免疫原性和反应原性;(3)制备的多克隆抗体与狂犬病病毒BD06、SRV 9、CVS-24、ERA、PV 2061及aG株的M蛋白均能发生特异性反应,但其无病毒中和能力。本研究完成了重组M蛋白的表达、纯化并制备了其多克隆抗体,为进一步研究M蛋白的生物学功能奠定了物质基础。     

狂犬病病毒糖蛋白重组人腺病毒的构建及免疫效果的初步研究

构建表达狂犬病病毒弱毒SRV9糖蛋白(GP)的重组人5型腺病毒,检测其对小鼠的免疫效果。将狂犬病病毒SRV9株GP基因的完整开放阅读框克隆到腺病毒表达系统中的穿梭质粒多克隆位点,构建重组穿梭质粒pac-Ad5CMV-Gs9,以罗氏转染液介导线性化骨架质粒和重组穿梭质粒共转染293AD细胞,细胞病变后取培养物进行PCR鉴定并电镜观察,在293AD细胞上测定病毒滴度。以106 TCID50重组腺病毒腹腔接种昆明小鼠,免疫后不同时段采尾静脉血通过荧光抗体病毒中和试验(FAVN)检测小鼠血清狂犬病中和抗体效价。正确构建重组穿梭质粒pacAd5CMV-Gs9;获得表达狂犬病病毒SRV9株GP蛋白的缺陷型重组人5型腺病毒;病毒滴度达到106 CFU/mL以上;腹腔接种小鼠14d后均产生了抗狂犬病中和抗体,有效保护率达90%。成功获得了表达狂犬病病毒GP基因的重组腺病毒,该腺病毒免疫小鼠可产生保护性中和抗体,为进一步开发新型兽用狂犬病疫苗奠定了物质基础。     

人巨细胞病毒包膜糖蛋白B主要中和表位单克隆抗体的制备

人巨细胞病毒(Human Cytomegalovirus,HCMV)分布广泛,能够引发多种疾病,人群感染率极高,严重威胁到人类健康。现根据标准毒AD169基因序列,人工合成包膜糖蛋白B(glycoprotein B,g B)AD13区段的主要中和抗原表位AD-1、AD-2、AD-3,并将其与表达载体pET-32a连接,构建重组表达质粒;用IPTG诱导表达重组蛋白,采用Western-blot进行特异性鉴定;将纯化后的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞和SP2/0细胞融合,然后筛选制备AD13单克隆抗体(monoclonal antibody,m Ab)。12%SDS-PAGE电泳鉴定表明重组蛋白表达成功,其相对分子质量约为35 kD;Western-blot和间接ELISA结果说明,重组AD13蛋白作为抗原具有良好的免疫反应性;克隆化后筛选到5个AD13单克隆抗体细胞株,经间接ELISA鉴定,与AD13抗原有良好的特异性反应。上述研究为研发HCMV快速诊断试剂盒提供了原料,也为研究HCMV亚单位疫苗提供了相关的基础。     

人源抗发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒-Gn蛋白重组抗体的研究

为研制人源抗发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus,SFTSV)Gn蛋白重组抗体,本研究利用噬菌体表面展示技术,以SFTSV全病毒颗粒和重组表达SFTSV-Gn蛋白为抗原,从人源抗SFTSV Fab噬菌体抗体库中筛选抗SFTSV-Gn蛋白的重组Fab抗体,通过ELISA对Fab抗体的结合特异性进行检测。将Fab抗体基因克隆入哺乳动物细胞表达载体HL51-14,瞬时转染293T细胞获得分泌表达的IgG抗体。通过ELISA、IFA和Western-blotting检测IgG抗体的结合特异性。采用亲和层析纯化IgG抗体,并用微量中和试验检测IgG抗体的中和活性。结果表明经过三轮富集筛选,以SFTSV病毒颗粒为抗原筛选出364株针对SFTS病毒核蛋白Fab抗体,没有筛选出特异性结合Gn蛋白的阳性克隆,而通过Gn蛋白筛选得到8株特异结合Gn蛋白的Fab抗体,其中5株来自Lambda库,3株来自Kappa库。ELISA、IFA和Western-blotting检测证实这8株IgG抗体均能特异性结合Gn蛋白。微量中和试验显示8株新筛抗体没有中和活性,但仍可为后续SFTSV人源单克隆抗体的研究提供借鉴和参考。     

水痘-带状疱疹病毒糖蛋白N的单克隆抗体制备及初步研究

水痘-带状疱疹病毒(VZV)是水痘和带状疱疹的共同致病原,其糖蛋白N(gN)在子代病毒的组装、成熟和出胞过程中发挥重要作用。但是目前关于VZV gN的研究还很少,其蛋白性质和具体分子功能仍不清楚。本研究目的是制备抗VZV gN的单克隆抗体,对该蛋白在VZV感染细胞和人皮肤组织内的表达和分布情况进行初步探究。本研究选择抗原性和亲水性较强的gN区段基因,构建rGST-gN融合蛋白的原核表达质粒,将鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌后用IPTG诱导融合蛋白表达,经亲和层析柱纯化rGST-gN融合蛋白后使用PSP酶切除GST标签,将获得的重组蛋白rgN免疫BALB/c小鼠,使用杂交瘤技术制备其单克隆抗体;共获得24株稳定分泌抗VZV gN单克隆抗体的杂交瘤细胞株,选取其中一株性能最优的12E10进行单克隆抗体生产纯化和抗体鉴定;单克隆抗体12E10为IgG2a亚型,其ELISA效价达到1∶10 000;通过Western blot、免疫荧光及免疫组织化学染色方法鉴定,该抗体能够特异性识别细胞和组织中表达的VZV gN;本研究应用该抗体首次确定了gN在VZV感染细胞中的反式高尔基体定位,并且确定了gN在VZV感染人皮肤组织中的表达。以上工作为今后深入研究VZV gN功能奠定了基础。     

入源中和性抗甲型肝炎病毒抗体Fab段基因的序列分析及可溶性表达

在用噬菌体表面呈现系统获得人源抗甲型肝炎(甲肝)病毒中和性基因工程Fab抗体的基础上,对所获得的4株中和性Fab抗体轻重链可变区基因进行了序列分析、可溶性表达及生物学特性鉴定.4株Fab抗体重链可变区拥有99%同源的核苷酸序列和相同的CDR区氨基酸序列,属于VHⅢ基因家族.而轻链可变区核苷酸序列同源性为95%和相似的CDR区氨基酸序列,属于VL5基因家族.这些重组抗体都能与人甲肝恢复期血清及具有中和活性的鼠抗甲肝单克隆抗体产生竞争抑制反应,表明其针对甲肝病毒结构蛋白上的主要抗原决定簇.     

幽门螺杆菌尿素酶B单位DNA疫苗的构建及鉴定

报告了利用淋巴细胞杂交瘤技术制备抗呼吸道合胞病毒蛋白的鼠单克隆抗体。获得 7株分泌抗呼吸道合胞病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株 :IF12 ,4H10 ,1D8,2B2 ,1G8,4G6 ,2D2。其中IF12 ,4H10 ,1D8,2B2 ,4G6分泌的抗体类别为IgG1,1G8为IgG2a ,2D2为IgG2b。经免疫印迹分析证实单抗 1F12 ,2B2识别病毒 4 4ku的蛋白 ,单抗1G8识别 37ku蛋白 ,2D2识别 2 1ku的病毒蛋白 ,单抗4G6识别病毒 90ku蛋白。对单抗的生物学活性进行了分析 ,单抗 4G6对呼吸道合胞病毒有明显的中和作用 ,小鼠腹水的中和滴度为 1∶32 ,其余各单抗中和滴度均小于1∶4。…     

重组人巨细胞病毒(HCMV)优势表位嵌合抗原的构建表达以及捕获法检测IgM抗体

勘误：重组人巨细胞病毒(HCMV)优势表位嵌合抗原的构建表达以及捕获法检测 IgM 抗体     

应用噬菌体展示技术筛选人巨细胞病毒糖蛋白M新的中和抗原表位

人巨细胞病毒(HCMV)糖蛋白复合物Ⅱ包括两种蛋白,即糖蛋白M(gM)和糖蛋白N(gN)．尽管来自于HCMV阳性病人血清中的糖蛋白复合物Ⅱ的IgG抗体能够中和HCMV粒子,但迄今为止,还没有gM中和性抗原表位的相关研究．应用消减杂交技术,通过噬菌体肽库筛选获得gM抗原的一个表位,即MAD．MAD氨基酸序列与gM第32～38位序列高度同源．将MAD与钥孔血蓝蛋白偶联免疫小鼠可产生抗MAD多抗,该多抗不仅结合天然HCMV病毒粒子,而且特异结合重组表达的gM30～78多肽．ELISA结果表明MAD能够特异结合HCMV阳性的病人血清．病毒中和实验结果进一步证明抗MAD多抗能够抑制HCMV AD169株病毒感染人胚肺细胞．总之,MAD表位有可能成为HCMV病毒疫苗潜在的保护性抗原.     

表达乙型脑炎病毒E蛋白重组减毒沙门菌活载体疫苗株的构建

目的:构建表达乙型脑炎病毒(JEV)E蛋白的口服重组减毒鼠伤寒沙门菌活载体疫苗株。方法:克隆JEV E基因,将其插入表达载体pYA3341中,构建重组质粒pYA3341-E,将重组质粒电转入鼠伤寒沙门菌疫苗株X4550(缺失asd、cya、crp基因),获得重组疫苗菌株X4550(pYA3341-E);鉴定重组菌E蛋白的表达,测定重组菌的稳定性、生长曲线、安全性,以及小鼠的免疫试验和血清中和试验。结果:酶切鉴定和序列测定证实重组质粒构建成功;SDS-PAGE检测有目的蛋白条带;Western印迹证实表达的E蛋白能与猪抗JEV阳性血清特异性结合;重组菌株在体外营养选择压力下,可稳定地携带重组质粒传代繁殖,在体内可较稳定地定居于肠系膜淋巴结和脾脏;小鼠口服试验证实重组菌无毒性作用,安全可靠;小鼠口服重组菌免疫,ELISA检测产生了抗JEV抗体;中和试验表明产生的抗体具有中和活性。结论:构建了能稳定表达JEV E蛋白的口服减毒鼠伤寒沙门菌疫苗株X4550(pYA3341-E),为研究乙型脑炎口服基因工程疫苗奠定基础。     

一种人源抗狂犬病病毒单克隆抗体的瞬时表达及性质分析

目的瞬时表达人源重组抗狂犬病病毒单克隆抗体,并对抗体性质进行分析。方法 PCR法扩增抗体轻、重链可变区并分别构建真核表达质粒;瞬时转染HEK293 EBNA1细胞;抗体经亲和纯化后,CE-SDS法分析纯化后抗体单体比例,用快速荧光灶抑制试验(RFFIT)分析抗体体外抗狂犬病病毒中和活性,ELISA分析抗体与3aG、CTN、PV及CVS株的结合。结果提取瞬时表达质粒的A260/280 nm比值在2.0～2.1之间纯化后抗体非还原CE-SDS单体纯度为74.4%;还原CE-SDS抗体轻、重链峰合计占比超过95%;抗体RFFIT体外中和活性为293.37 IU/mL,比活达628.21 IU/mg,抗体与3aG、CTN、PV及CVS株交叉反应均为阳性。结论该株抗体具有较高体外抗狂犬病病毒中和活性,与主要疫苗株均有较强结合。     

人乳头瘤病毒16型假病毒中和实验的建立和初步应用

探讨了应用多质粒磷酸钙共转染方法在293FT细胞中生产HPV16(human papillomavirus type 16)假病毒。蛋白印迹检测显示在转染后细胞的裂解上清中具有很好的L1蛋白活性,通过透射电镜可观察到形态与天然病毒粒子相似的假病毒颗粒。对293FT细胞的感染实验显示,该假病毒可有效将EGFP报告质粒导入靶细胞中进行表达,经测定其滴度约为2×107TU/mL。通过与4株HPV16对照单抗的中和实验证明该假病毒可有效应用于中和实验。应用该方法从18株抗HPV16L1的单克隆抗体中鉴定获得了2株中和单抗3D10、PD1。所建立的HPV16假病毒生产和中和实验方法具有快速高效、低成本和易于检测的优点,适于进行较大规模应用,为快速准确鉴定HPV16中和单抗和候选疫苗的免疫保护效果提供了有效手段。     

犬瘟热病毒H蛋白基因重组腺病毒的构建及免疫效果评估

研究选取犬瘟热病毒H蛋白基因为目的基因,利用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、酶切、连接等方法构建出重组人5型腺病毒穿梭质粒和骨架质粒,两者共转染293AD细胞并包装出重组腺病毒。通过电镜负染、酶切鉴定、Western blot及一步生长曲线测定等方法进行病毒的生物学特性鉴定,证明犬瘟热病毒H蛋白基因重组腺病毒构建正确。犬分别肌肉接种CDV疫苗毒和重组腺病毒,并检测免疫后第14,28,42,56,70,84d时犬血清中抗CDV中和抗体的变化情况。结果显示,犬免疫重组腺病毒后体内产生的抗CDV平均中和抗体水平高于对照组,滴度最高达2-8。研究表明,正确构建的重组腺病毒具有良好的免疫原性,诱导产生的抗犬瘟热病毒中和抗体达到犬最低免疫保护水平,为进一步研发犬瘟热病毒活载体疫苗提供理论依据。     

重组痘苗病毒表达人免疫缺陷病毒中国株B'亚型Gag蛋白及免疫效果观察

为筛选用于我国HIV疫苗的候选基因,利用痘苗病毒载体构建表达HIV-1 B′亚型中国流行株RL42的Gag蛋白的重组病毒rVV-RL42gag,并免疫BALB/c小鼠,检测其诱导的特异性抗体及中和抗体,同时检测其诱导的特异性CTL及与中国流行株C(B′/C重组)亚型和国际流行株A亚型之间的CTL交叉反应.结果显示:重组病毒能很好地表达Gag蛋白,它具有与7株单克隆抗体结合的抗体表位;电镜下可观察到Gag蛋白形成的颗粒.rVV-RL42gag免疫小鼠后能诱导产生高滴度的特异性抗体和CTL,抗体具一定的中和活性,且检测到与C(B′/C重组)亚型和国际流行株A亚型之间的CTL交叉反应.这些结果表明,rVV-RL42gag具有良好的免疫原性,可进一步构建表达HIV B′亚型中国流行株RL42的Gag蛋白的重组痘苗病毒作为候选疫苗.     

HCMV截短UL83基因真核表达重组体的构建、转染及其免疫效力研究

为了构建人巨细胞病毒(HCMV)截短UL83基因真核表达重组体,实现其在Hep-2细胞中的稳定表达,研究该截短UL83基因真核表达重组体免疫效力,采用基因重组的方法,将HCMV AD169株截短UL83基因定向克隆到带有绿色荧光蛋白(GFP)作为报告基因的真核表达载体pEGFP-C1上,构建真核重组表达质粒pEGFP-C1-UL83;脂质体转染至Hep-2细胞中,G418筛选获得稳定表达pp65细胞表达系。经基因测序显示,重组体中截短UL83基因完全正确,RT-PCR和Western blot检测证实其可在Hep-2细胞中稳定表达。用该重组体和其表达产物在HCMV先天性感染小鼠模型上进行免疫保护试验显示,母鼠血清可检测到特异性抗HCMV pp65抗体,效价为:1∶2.51~1∶50.79;子鼠脑组织内未分离出病毒,亦未检测出病毒pp65蛋白抗原表达。初步结果表明,pEGFP-C1-UL83具有较好的免疫原性,可作为DNA疫苗刺激机体产生有效抗体,并具有阻止病毒垂直传播的保护性作用。     

新城疫病毒F蛋白在昆虫细胞中的表达及其融细胞作用

用RT-PCR方法扩增出新城疫病毒标准强毒株F48E8的F基因,并将其克隆到pGEM-T载体,命名为pGEM-NDF.鉴定正确后,以BamHI和XbaI双酶切将F基因从pGEM-NDF中释放出来,并插入到pFast Bac I载体中,得到重组转移载体pFast-NDF.然后将该重组质粒转入含有穿梭质粒的感受态DH10Bac中,通过转座作用获得重组穿梭质粒reBacmid-NDF.再用reBacmid-NDF转染Sf9昆虫细胞,获得含有新城疫病毒F48E8株F基因的重组杆状病毒.间接免疫荧光和Western-blot分析结果表明F蛋白在昆虫细胞中获得表达,而且主要表达于细胞膜上,并使感染重组杆状病毒的昆虫细胞在96h发生融合作用.动物试验表明,表达的F蛋白能够产生中和抗体.本文的研究结果为F蛋白的进一步开发奠定了基础.     

AAV介导的H7N9单克隆抗体在体内高效表达

2013年,我国安徽、上海两地暴发了甲型流感病毒H7N9感染,造成了巨大的生命财产损失。至今仍无可用H7N9疫苗上市。近来,研究人员鉴定了多株H7N9中和抗体。但由于抗体在体内半衰期较短,限制了其作为长效预防手段控制H7N9感染的作用。AAV(Adeno-associated virus)作为基因治疗载体,具有低免疫原性的特征,并可介导外源基因在体内长期稳定表达。本实验中,我们利用重组AAV介导H7N9的两种单克隆中和抗体HNIgGD5和HNIgGH8在体内长期高水平表达以预防H7N9的感染。结果显示,我们所构建的重组AAV-抗体表达系统可以在细胞水平和实验动物体内介导病毒中和抗体高水平表达。其中在小鼠体内HNIgGD5表达量达到199.9μg/mL,HNIgGH8高达430.9μg/mL。这将为利用中和抗体预防H7N9感染提供新策略。尤其是对于疫苗非适用人群,如免疫缺陷患者、老人、儿童和孕妇等预防流感入侵具有重要意义。     

新城疫病毒F蛋白在昆虫细胞中的表达及其融细胞作用

用RT-PCR方法扩增出新城疫病毒标准强毒株F48E8的F基因,并将其克隆到pGEM-T载体,命名为pGEM-NDF。鉴定正确后,以BamHI和XbaI双酶切将F基因从pGEM-NDF中释放出来,并插入到pFastBacI载体中,得到重组转移载体pFast-NDF。然后将该重组质粒转入含有穿梭质粒的感受态DH10Bac中,通过转座作用获得重组穿梭质粒reBacmid-NDF。再用reBacmid-NDF转染Sf9昆虫细胞,获得含有新城疫病毒F48E8株F基因的重组杆状病毒。间接免疫荧光和Western-blot分析结果表明F蛋白在昆虫细胞中获得表达,而且主要表达于细胞膜上,并使感染重组杆状病毒的昆虫细胞在96h发生融合作用。动物试验表明,表达的F蛋白能够产生中和抗体。本文的研究结果为F蛋白的进一步开发奠定了基础。