目的Ribozyme两侧长片段附加序列（LAS）的去除及其转录载体构建

选择小鼠腺苷脱氨酶ｍＲＮＡ特异Ｒｉｂｏｚｙｍｅ做为目的Ｒｉｂｏｚｙｍｅ（Ｒｚ）,在目的Ｒｉｂｏｚｙｍｅ两侧分别设计５＇－顺式Ｒｚ和３＇－顺式Ｒｚ,在目的Ｒｉｂｏｚｙｍｅ上设计ＢａｍＨＩ酶切位点,并构建了上述Ｒｉｂｏｚｙｍｅ转录载体ｐＳＣＲｚ２６２,采用该质粒进行体外转录,并对转录靶ＲＮＡ分子进行了切割反应。结果显示ｐＳＣＲｚ２６２在转录过程中发生了自身切割,并释放出目的Ｒｉｂｏｚｙｍｅ－Ｒｚ２６２,该目的Ｒｉｂｏｚｙｍｅ不但去除了两侧长片段附加序列,而且保持了正确的生物学活性,通过ＢａｍＨＩ切点的设计简化了该质粒的筛选。     

核酶对bcl－2mRNA的体外切割

通过微机对ｂｃｌ－２ＲＮＡ二级结构的分析,设计针对ｂｃｌ－２片段５＇ＣＧＣＧＡＣＣＣＧＧＵＣＧＣＣＡＧＧＡＣＣＵＣＧ３＇的“锤头状”（Ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ）核酶（Ｒｉｂｏｚｙｍｅ,ＲＤ）基因,平端连接于ｐＧＥＭ－３Ｚｆ（－）ＨｉｎｃⅡ位点,克隆后经测序表明序列正确,ｂｃｌ－２和Ｒｉｂｏｚｙｍｅ基因经体外转录,５０℃作用２ｈ,从１６５６－１６５７（Ｃ－Ｇ）位之间切断ｂｃｌ－２ＲＮＡ片段．     

混合Ribozyme联合切割小鼠腺苷脱氨酶mRNA研究

采用计算机辅助设计得到针对小鼠腺苷脱氨酶ｍＲＮＡ的４种ｒｉｂｏｚｙｍｅ,它们均能在各自的切点切割ＲＮＡ分子,４种ｒｉｂｏｚｙｍｅ经组合后成混合ｒｉｂｏｚｙｍｅ,它们分别含有２种、３种和４种ｒｉｂｏｚｙｍｓ。通过对体外转录靶ＲＮＡ分子的联合切割研究表明,随着ｒｉｂｏｚｙｍｅ种数的增加,其中以（Ｒｚ２６２＋Ｒｚ４５５＋Ｒｚ５８３）组成最为理想,由此证明混合ｒｉｂｏｚｙｍｅ中,各种ｒｉｂｏｚｙｍｅ不仅保     

人I型胶原基因第一内含子调节转录的研究

人Ｉ型胶原α１（Ｉ）链（ＣＯＬＩＡ１）基因内含子序列在不同细胞内有不同的转录调节活性,报道了含人ＣＯＬＩＡ１基因内含子Ｉ不同区段（＋５４４～＋８５５和＋８２０～＋１０９３）的重组质粒ｐＳＣＥＰ－ＣＡＴ和ｐＳＣＩＰ－ＣＡＴ的构建并转染人胚肌腱成纤维细胞和Ｔｃａ８１１３舌癌细胞,地高辛标记抗ＣＡＴ－ＥＬＩＳＡ检测结果显示：ｐＳＣＥＰ－ＣＡＴ在两种细胞均获表达;ｐＳＣＩＰ－ＣＡＴ在人成纤维细胞未表达,但     

利用脊髓灰质炎病毒5‘NCR和RNA聚合酶基因可提高外源基因表达

将含脊髓灰质炎病毒（ＰＶ）ＲＮＡ聚合酶的不同长度基因片段克隆到载体ｐＳＧ５质粒上,分别构建了４个表达ＲＮＡ聚合酶的质粒。体外转录实验证明,ｐＳＧ５－ＰＯＬ１．９９和ｐＳＧ５－ＰＯＬ２．０３质粒转染细胞的提取物促进了特异的ＲＮＡ转录,表明两质闰可表达ＲＮＡ聚合酶。将ＰＶ的５’ＮＣＲ序列插在载体ｐＧＲＥＥＮ ＬＡＮＴＥＲＮ－１的ＣＭＶ启动子下游,构建了ｐＧＲＥＥＮ ＬＡＮＴＥＲＮ－１－５’ＮＣＲ质粒;     

hGM－CSF基因及其调控研究进展

人粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子基因表达受到转录调控与转录后调控。５＇非转录区的一些顺式调控成分,如ＣＡＴＴ（Ａ／Ｔ）重复序列,富含ＧＣ序列,ＣＫ－１、ＣＫ－２、ｋＢ特异序列与可诱导的ＣｓＡ敏感增强子成分等在转录水平上调控ｈＧＭ－ＣＳＦ的表达。３＇非翻译区有一６２ｂｐ富含ＡＵ序列,这与ｍＲＮＡ的稳定性相关,在翻译水平调控ｈＧＭ－ＣＳＦ的表达,细胞因子与一些刺激因子通过不同的机制作用于ｈＧＭ－ＣＳＦ基     

HCV5＇端非编码区cDNA的体外转录

采用逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）从广东省一例慢性丙型肝炎病人血清中获得丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）５＇端非编码区（５＇ＮＣＲ）３０２ｂｐ的ｃＤＮＡ片段,经补齐和提纯后插入ｐＵＣ１９质粒,获得的重组体ｐＵＮ进行序列测定。将ｐＵＮ的目的基因亚克隆进体外转录载体ｐＳＰＯＲＴＩ多克隆位点的ＥｏｏＲＩ和ＰｓｔＩ切点之间,所得重组体ｐＳＮ线性化后由Ｔ＿７ＲＮＡ多聚酶及ＳＰ６ＲＮＡ多聚酶引导体外转录反应,产物经凝胶电泳及特异引物ＲＴ－ＰＣＲ,证实ＳＰ６引导的是正义ＲＮＡ,Ｔ７合成的是反义ＲＮＡ,其大小分别力４２９ｂｐ和３６２ｂｐ。并证实所得ＲＮＡ力ＨＣＶ５＇ＮＣＲｃＤＮＡ转录而来。获得的ＨＣＶ５＇ＮＣＲｃＤＮＡ和ＲＮＡ在常规逆转录和ＰＣＲ步骤中用于设立有效的模板对照,对消除假用性及评估试剂有重要意义。同时,ＨＣＶ５＇ＮＣＲ体外转录载体的构建可用于制各ＲＮＡ探针和反义ＲＮＡ,改进后还可作为定量ＰＣＲ的竞争性模板。     

HCV5′端非编码区cDNA的体外转录

采用逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）从广东省一例慢性丙型肝炎病人血清中获得丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）５′端非编码区（５′ＮＣＲ）３０２ｂｐ的ｃＤＮＡ片段,经补齐和提纯后插入ｐＵＣ１９质粒,获得的重组体ｐＵＮ进行序列测定,将ｐＵＮ的目的基因亚克隆进体外转录载体ｐＳＰＯＲＴＩ多克隆位点的ＥｃｏＲｆｆＩ和ＰｓｔＩ切点之间,所得重组体ｐＳＮ线性化后由Ｔ７ＲＮＡ多聚酶及ＳＰ６ＲＮＡ多聚酶引导体外转录反应,产物     

特异切割12-脂加氧酶mRNA的核酶体外活性及动力学研究

根据锤头状核酶（Ｒｉｂｏｚｙｍｅ）的作用模式,设计、合成并克隆了特异性切割１２－脂加氧酶（１２－ＬＯ）ｍＮＲＡ的核酶基因。以合成的２５个核苷酸长的１２－脂加氧酶ＲＮＡ片段为底物与转录的核酶ＲＮＡ一起保温检测其体 割活性。实验结果表明,在３７℃保温时,核酶在体外对１２－脂加氧酶具有较高的特异切割活性,其Ｋｍ值为１３００ｎｍｏｌ／Ｌ,其ｋｃａｔ值为０．０８３／ｍｉｎ,在５０℃保温时,核酶具有很高的切割     

GL—7—ACA酰化酶在大肠杆菌中的分泌表达

利用来自假单胞菌的ＧＬ－７－ＡＣＡ酰化酶的信号肽和表达元件基因片段构建了ＧＬ－０７－ＡＣＡ酰化酶的分泌型高表达质粒ｐＴｒｃＣＡ１Ｓ和ｐＫＫＣＡ１Ｓ,其中ｐＴｒｃＣＡ１Ｓ为ＩＰＴＧ诱导型质粒,ｐＫＫＣＡ１Ｓ为组成型质粒。ｐＴｒｃＣＡ１Ｓ和ｐＫＫＣＡ１Ｓ转入受体菌ＴＧ１中都可高表达ＧＬ－７－ＡＣＡ酰化酶基因并将表达产物转运到周质空间,完整细胞酰楷酶比活力分别为２３．９单位每克菌体和１８．３单位每克菌体     

利用PCR技术行反义寡核苷酸体外抗丁型肝炎病毒基因组RNA中核酶的研究

设计一对ＰＣＲ引物,其中上游引物的５’端除目的基因外,还加Ｔ７ＲＮＡ聚合酶启动子序列,以质粒（ｐＳＶＬＤ３）为模板,通过ＰＣＲ扩增出带有Ｔ７ＲＮＡ聚合酶启动子序列的１３９ｂｐ的ｃＤＮＡ片段,它含有丁型肝炎病毒（ＨＤＶ）基因组ＲＮＡ中核酶（Ｒｉｂｏｚｙｍｅ）区的ｃＤＮＡ该核酶具有自身裂解功能,经测序发现该ｃＤＮＡ有２个碱基变异,以此ＰＣＲ产物为模板,通过Ｔ７ＲＮＡ聚合酶,转录出核酶的前体,并观察到其     

特异切割马铃薯卷叶病毒复制酶基因负链的核酶研究

根据锤头状核酶的作用模式,设计、合成并克隆了特异性切割马铃薯地病毒中国分离株（ＰＬＲＶ－Ｃｈ）复制酶基因负链ＲＮＡ的核酶序列,以体外转录的ＰＬＲＶ－Ｃｈ复制酶基因负链ＲＮＡ作为底物,与转录的核酶ＲＮＡ共同保温,以检测核酶对底和的体外切割作用。实验结果表明,核酸疼 ＲＮＡ对ＰＬＲＶ－Ｃｈ复制酶基因负锭ＲＮＡ具有特异切割作用。     

hBMP－2cDNA在COS细胞和小鼠肌肉中的表达

研究了骨形态发生蛋白ＢＭＰ－２ｃＤＮＡ在ＣＯＳ细胞和小鼠肌肉中的表达的情况,从ｐＳＰＳ６５ＢＭＰ－２质粒中回收ＢＭＰ－２ｃＤＮＡ,删除５＇端的非翻译序列,插入ｐＳＶＬ载体中,构建了含有ＢＭＰ－２全长编码序列的重组表达质粒ｐＳＶＬＢＭＰ－２。将表达质粒导入ＣＯＳ－７细胞中,细胞ＲＮＡ点杂交结果表明,转染ＢＭＰ－２基因的细胞内ＢＭＰ－２的ｍＲＮＡ水平明显升高;细胞培养上清的ＥＬＩＳＡ显示,转染ＢＭＰ－２ｃＤＮＡ后,细胞分泌产生的ＢＭＰ－２显著增加。小鼠实验发现,在肌肉内用注射法导入ＢＭＰ－２重组质粒后,局部组织内ＢＭＰ－２的ｍＲＮＡ转录水平也明显提高。     

人vigilin基因5'端调控区域的研究

在克隆了人基因组全长ｖｉｇｉｌｉｎ基因的基础上,对其５端转录调控区域再克隆,获得Ｖｉｇ－ＣＧ５－７Ｅ克隆,再用限制酶ＡｐａⅠ和ＥｃｏＲⅠ切除３端约４ｋｂ部分,得到Ｖｉｇ－ＣＧ５－７Ｅ３ＡＥ克隆,并对该克隆进行双向测序分析．结果表明：克隆Ｖｉｇ－ＣＧ５－７Ｅ用ＡｐａⅠ酶消化后,用ｃＤＮＡ上游开始的２０个碱基组成的寡聚核苷酸做探针进行分子杂交,可见一条小于０．１ｋｂ杂交带,根据物理图谱分析,位于Ｖｉｇ－ＣＧ５－７Ｅ３ＡＥ克隆的ＡｐａⅠ端,从而推断该克隆含有转录调控元件,５端序列分析得到二个ＴＡＴＡ盒,一个ＣＡＡＴ盒和一个ＧＣ盒以及二个可能的Ａｐ－１和Ａｐ－２结合位点．认为ＧＣ盒可能为人ｖｉｇｉｌｉｎ基因启动子的组成部分     

新型大肠杆菌裂解系统在重组蛋白回收中的应用

溶菌酶通过降解细菌细胞壁的肽聚糖裂解细菌,利用此特性,构建温度敏感的内源裂解系统,达到高效释放和回收重组蛋白的目的。构建了温度敏感的Ｔ４溶菌酶基因表达质粒ｐＳＣ－ｌｙｓ（ｐＳＣ１０１复制子）和ｐ１５Ａ－ｌｙｓ（ｐ１５Ａ复制子）,质粒与工程菌构成了新型内源裂解系统,系统可以与高拷贝复制子（如ｐＭＢ１,ＣｏｌＥ１）的重组蛋白表达擀粒兼容。结果表明,裂解系统的量适裂解条件由三个要素构成：ｐＳＣ－ｌｙｓ－     

水稻齿叶矮缩病毒Segment 9 dsRNA的序列分析及其在大肠杆菌DE3中的…

通过有机试剂抽提,ＣＦ－１１纤维素柱层析,从感染水稻齿叶矮缩病毒菲律宾分离株（ＲＲＳＶ－Ｐ）的水稻植株中获取该病毒的全基因组,即获得从Ｓｅｇｍｅｎｔ １到Ｓｅｇｍｅｎｔ １０（Ｓ１－Ｓ１０）的１０条双链ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）,然后设计合适的引物,用ＲＴ－ＰＣＲ方法得到Ｓ９的ｃＤＮＡ并将其克隆到ｐＵＣ１１９质粒上扩增,以双链测序法测定该ｃＤＮＡ的全序列。同时又将此ｃＤＮＡ克隆到大肠杆菌表达质粒ｐＧＥＸ     

764－3对血管平滑肌细胞增殖的影响

为寻找新型有效的ＡⅡ拮抗剂,本实验应用细胞计数、￣３Ｈ－ＴｄＲ掺入、逆转录─聚合酶链反应及放射免疫实验方法,研究了中药单体７６４－３对卒中易感型自发性高血压大鼠（ＳＨＲｓｐ）及其对照（ＷＫＹ大鼠）主动脉平滑肌细胞（ＡｓＭＣ）增殖的影响及其作用机制。结果表明：７６４－３可显著抑制ＡＳＭＣ增殖,并有剂量依赖性。２０ｍｇ／Ｌ的７６４－３可极显著地抑制ＡＳＭＣ上ＡⅡ受体（ＡＴ＿１）的ｍＫＮＡ表达（ＳＨＲｓｐ下降７６．３％,ＷＫＹ大鼠下降６１．６％）,并可降低ＳＨＲｓｐＡＳＭＣ内ＡⅡ含量（下降２０％）。推测７６４－３对ＡＳＭＣ增殖的抑制作用可能部分地是由于降低了ＡＴ＿１受体的基固表达引起。比较其对两种大鼠ＡＳＭＣ的抑制效率,发现它对ＳＨＲｓｐ的ＡＳＭＣ的作用更强。     

诱生型一氧化氮合酶基因启动子的结构及其调控

鼠类ＮＯＳ２基因５′端１．７ｋｂ序列几乎包含了所有的顺式作用元件,其中ＮＦκＢ结合位点,ＩＲＦ－ＲＥ,ＣＡＡＴｂｏｘ和ＧＡＳ４等元件对该在的诱导性转录调控至关重要,人ＮＯＳ２基因５′端３．７ｋｂ范围与鼠类有相似的调控元件,但该区域仅有基础启动子活性,其诱导性调控元件在－３．７ｋｂ的上游,其中ＮＦκＢ结合位点着关键的作用。     

信号肽疏水性的提高促进青霉素G酰化酶分泌

设计和合成了一段具有连续１０仆亮氨酸强疏水核心的信号肽（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ,ＡＳＰ）,由ＥｃｏＲＩ－ＫｐｎＩ位点融合到青霉素Ｇ酰化酶（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ Ｇａｃｙｌａｓｅ,ＰＡＣ）信号肽（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ,ＷＴＳＰ）的－４Ｐｒｏ位点,分别构建了ＰＡＣ表达质粒：ｐＫＫｐａｃ△ＳＰ,ｐＫＫｐａｃＷＴＳＰ,ｐＫＫｐａｃＡＳＰ,ｐＥＴｐａｃ     

人T细胞白血病病霉Ⅰ型env基因的克隆与表达

本文通过聚合酶链式反应（ＰＣＲ）,从整合有人Ｔ细胞白血病病毒Ⅰ型（ＨＴＬＶ－Ｉ）的ＭＴ－２细胞株中,扩增出ＨＴＬＶ－Ｉ外膜蛋白（ｅｎｖ）的全基因（１．４５ｋｂ）,并成功地克隆入ｐＵＣ１９载体,构建成ｅｎｖ基因克隆ｅｎｖ／ｐＵＣ１９．利用原核高效表达载体ｐＧＥＸ－２Ｔ,在大肠杆菌中有效地表达了与谷胱甘肽Ｓ－转移酶（ＧＳＴ）融合的ｅｎｖ羧基末端抗原的重组蛋白,融合基因的转录由ｔａｃ启动子调控。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ结果表明,有一约５２ｋＤ的目的蛋白带,表达量占菌体总蛋白的１０％;ＷｅｓｔｅｒＮｂｌｏｔｔ及ＥＬＩＳＡ结果显示,表达产物能与ＨＴＬＶ－Ｉ多抗血清结合。本研究为研制ＨＴＬＶ－Ｉ的诊断试剂及进一步了解ｅｎｖ的免疫学和生物学性质打下了基础。