PNAS：发现SARS冠状病毒致命点

经过近六年努力，武汉大学科研人员近日发现了SARS冠状病毒致命点，是一组叫”非结构蛋白nsp14”的基因编码。研究人员表示，此次重要发现可为筛选抗击SARS病毒药物奠定基础，进而研发成小分子药物。这项研究成果近日在国际权威综合性学术期刊美国《国家科学院院报》（PNAS）上发表。     

武大发现非典病毒致命点基因编码

武大发现SARS冠状病毒致命点“非结构蛋白nsp14”的基因编码已刊载在国际权威综合性学术期刊《美国科学院院报》上。     

国家自然科学基金项目简介

正项目名称:DDX1在猪传染性胃肠炎病毒非结构蛋白nsp14激活NF-κB信号通路中的作用机制项目经费:25万项目主要内容:TGEV是引起仔猪腹泻的主要病原,能显著激活炎症相关转录因子NF-κB,前期研究发现nsp14在其中起关键作用,且DDX1直接影响nsp14对NF-κB的激活。项目拟明确nsp14对NF-κB的激     

东部马脑脊髓炎病毒的分子生物学进展

东部马脑脊髓炎病毒属虫媒病毒,能引起人和马发生急性脑炎。东马病毒为单股正链RNA病毒,可分为南美型和北美型,包括两个开放读码框架,分别编码结构蛋白（E1,E2,E2,C,6K）和非结构蛋白（nsp1,nsp2,nsp3,nsp4)。其中E1/E2包膜糖蛋白以异二聚体的形式病毒颗粒外刺突。非结构蛋白主要能与负链RNA的合成,近来,随着研究深入,病毒受体越来越受到广泛关注。本介绍东部马脑脊髓炎病毒结构、进化、复制、组装等方面的分子生物学进展。     

猪流行性腹泻病毒nsp1蛋白对Ⅰ型干扰素应答的影响

猪流行性腹泻病毒 (PEDV) 能抑制宿主Ⅰ型干扰素及其诱导的细胞抗病毒免疫应答,但是PEDV抑制Ⅰ型干扰素应答的分子机制尚不明了,尤其是PEDV非结构蛋白 (Nonstructural proteins,nsps) 在Ⅰ型干扰素应答中的调控作用研究不多。为研究PEDV非结构蛋白1 (nsp1) 对细胞Ⅰ型干扰素应答的影响,构建了真核表达载体pCAGGS-nsp1,采用Western blotting和间接免疫荧光试验确定nsp1在细胞中的表达。通过报告基因法、ELISA以及病毒复制抑制试验评估nsp1对Ⅰ型IFN的影响。结果显示,nsp1在转染细胞和病毒感染细胞中均高效表达;双荧光报告基因试验结果表明,nsp1能显著抑制IFN-β启动子活性,且具有剂量依赖性。ELISA结果显示,nsp1能显著抑制IFN-β蛋白的表达。水泡性口炎病毒 (VSV) 复制抑制试验结果显示,nsp1明显抑制poly(I:C)介导的Ⅰ型IFN的抗病毒作用。结果提示,nsp1作为PEDV的保守蛋白,具有拮抗Ⅰ型干扰素启动子活性和应答的功能,为揭示PEDV逃逸宿主天然免疫应答的机制和研发新型高效抗PEDV疫苗奠定基础。     

猪流行性腹泻病毒nsp1对Ⅰ型干扰素应答的影响

猪流行性腹泻病毒(PEDV)能抑制宿主Ⅰ型干扰素及其诱导的细胞抗病毒免疫应答,但是PEDV抑制Ⅰ型干扰素应答的分子机制尚不明了,尤其是PEDV非结构蛋白(Nonstructural proteins,nsps)在Ⅰ型干扰素应答中的调控作用研究不多。为研究PEDV非结构蛋白1(nsp1)对细胞Ⅰ型干扰素应答的影响,构建了真核表达载体p CAGGS-nsp1,采用Western blotting和间接免疫荧光试验确定nsp1在细胞中的表达。通过报告基因法、ELISA以及病毒复制抑制试验评估nsp1对Ⅰ型IFN的影响。结果显示,nsp1在转染细胞和病毒感染细胞中均高效表达。双荧光报告基因试验结果表明,nsp1能显著抑制IFN-β启动子活性,且具有剂量依赖性。ELISA结果显示,nsp1能显著抑制IFN-β蛋白的表达。水泡性口炎病毒(VSV)复制抑制试验结果显示,nsp1明显抑制poly(I:C)介导的Ⅰ型IFN的抗病毒作用。结果提示,nsp1作为PEDV的保守蛋白,具有拮抗Ⅰ型干扰素启动子活性和应答的功能,为揭示PEDV逃逸宿主天然免疫应答的机制和研发新型高效抗PEDV疫苗奠定基础。     

SARS冠状病毒Nsp14基因的克隆与表达

对SARS冠状病毒的非结构蛋白Nsp14的基因全长进行了克隆表达。根据公布的SARS冠状病毒的非结构蛋白Nsp14的基因序列设计引物,用PCR的方法把该基因从SARS冠状病毒的cDNA片段中扩增出来,经限制性内切酶BamHI与XhoI双酶切后插入到原核表达载体pET30a( )中,建成重组载体pET30a-Exo。重组载体转化大肠杆菌并进行诱导表达,通过原核表达的方法得到了该蛋白。这为该蛋白的进一步研究奠定了基础。     

猪流行性腹泻病毒非结构蛋白nsp9互作宿主蛋白对病毒复制的影响

猪流行性腹泻病毒(porcineepidemicdiarrheavirus,PEDV)导致仔猪和育肥猪发生急性肠道传染病，是危害养猪业最重要的病原体之一。目前发现PEDV能够编码至少16个非结构蛋白，其中nsp9能够结合至单链RNA中，但是其功能机制还不清楚。本研究通过免疫沉淀联合蛋白质谱分析，筛选出潜在的与PEDV nsp9宿主互作蛋白。通过进一步免疫共沉淀(co-immunoprecipitation, Co-IP)和激光共聚焦技术确认了nsp9与热休克蛋白HSPA8、Toll相互作用蛋白Tollip、热休克蛋白HSPA9、线粒体外膜蛋白TOMM70互作。其中，过表达HSPA8使nsp9的表达量先上调而后下调，并促进PEDV的增殖；过表达Tollip使nsp9的表达量显著上调，并抑制PEDV的增殖；过表达TOMM70使nsp9的表达量显著下调，但对PEDV的增殖无明显影响；过表达HSPA9对nsp9的表达以及PEDV的增殖均无明显影响。该研究为探索nsp9互作蛋白在PEDV感染过程中的功能提供了重要信息。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒TJ株致弱过程中遗传变异和致病性分析

为了研制高致病性猪繁殖与呼吸综合征(HP-PRRS)弱毒疫苗,将高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)TJ株进行了致弱驯化,在Marc-145细胞上对其进行了连续传代,每5～10代进行噬斑克隆纯化病毒。对致弱过程中不同代次病毒进行遗传变异及致病性分析。结果表明,TJ株在致弱过程中各基因均存在不同程度的变异,至第140代,共有58个氨基酸发生突变,同时在非结构蛋白nsp2区域,在不连续的30个氨基酸缺失(481位和533～561位)之后又出现连续120个氨基酸的缺失,与VR-2332相比,该缺失位点位于推定氨基酸序列的628～747位。动物接种试验结果表明,TJ株经Marc-145细胞传至第20代时,病毒对猪的致病性明显减弱,推测TJ株在这一传代过程中非结构蛋白nsp2-nsp5、nsp7和结构蛋白GP5所发生的遗传变异对病毒毒力致弱起到一定作用。     

前沿

每个人都有 L-SIGN 蛋白,那是因为人体基因组中含有一个与生俱来的编码L-SIGN 的基因。来自香港大学的研究人员发现 L-SIGN 蛋白结构和数目的不同会直接影响人体消灭SARS 病毒的能力,这项研究结果刊登在《自然·遗传学》杂志上。研究者之一的林成龙副教授指出,L-SIGN 基因由父系和母系基因组成,若父、母系 L-SIGN 基因的长度一致,即称之为纯合子,带有纯合子 L-SIGN 基因的人编码出的 L-SIGN 蛋白能集中“吸住”SARS 病毒,防止 SARS 病毒攻击健康细胞。实际的病例研究结果也证实了这一观点。研究人员     

SARS病毒免疫学性状的结构基础分析

运用生物信息学技术,对SARS冠状病毒基因组及其编码区进行了全序列分析,根据其基因和推导蛋白结构特点及同源性分析,探索SARS病毒主要结构蛋白免疫学性状的结构基础及进一步进行免疫学研究的线索,为深入SARS病毒的诊断预防工作提供参考 。     

SARS冠状病毒复制酶蛋白nsp8的原核表达

以SARS冠状病毒(BJ01株)基因组RNA为模板,经RT-PCR扩增得到SARS-CoVnsp8基因,并克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中,构建重组质粒pNSP8E。pNSP8E转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达出可溶性的GST-nsp8融合蛋白,经亲和层析和自剪切获得了高纯度nsp8蛋白。以nsp8为抗原免疫家兔,制备了nsp8的多克隆抗体,为下一步研究其在病毒感染的细胞中的功能奠定了基础。     

与PRRSV nsp11互作的宿主细胞蛋白鉴定及生物信息学分析

【目的】研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)nsp11与宿主细胞蛋白之间的相互作用,对于揭示nsp11在病毒复制过程中发挥的功能至关重要。【方法】在病毒感染细胞的基础上,利用nsp11的单克隆抗体,采用免疫沉淀结合串联质谱的方法,筛选与PRRSV nsp11相互作用的宿主细胞蛋白,并对所筛选出的宿主细胞蛋白进行了GO注释、COG注释和KEGG代谢通路注释;选取筛选出的宿主细胞蛋白IRAK1,利用免疫共沉淀技术和激光共聚焦技术鉴定其与nsp11之间的相互作用。【结果】与空白对照组相比,病毒感染组中出现3条差异带;经质谱分析共筛选得到了201个与nsp11相互作用的宿主细胞蛋白,分别与蛋白质代谢、细胞信号通路转导以及病原致病性等密切相关;在生物信息学分析的基础上,实验验证了nsp11确与宿主细胞蛋白IRAK1进行相互作用。【结论】鉴定出与PRRSV nsp11相互作用的宿主细胞蛋白,生物信息学分析显示它们在病毒的复制和致病过程中发挥重要作用。研究结果为探究nsp11的生物学功能指明了方向,也为研究宿主细胞蛋白与病毒蛋白间的相互作用及其调控病毒复制和致病性的分子机制奠定了基础。     

重组SARS病毒N蛋白可与SARS患者血清发生特异反应

N蛋白是SARS CoV病毒基因组编码病毒核衣壳蛋白 ,它不同于现已知的任何蛋白质 .对它的深入研究对揭示SARS -CoV的致病机理和疫苗及诊断试剂的研制有重要意义 .灭活的病毒经逆转录后 ,用根据已知的病毒的基因组序列所设计的引物PCR扩增N蛋白基因 .扩增出的基因经序列分析表明和已知的序列完全一致 ,共编码 4 2 2个氨基酸残基 .将N蛋白基因克隆入原核表达载体pET2 8a构建成表达质粒pET2 8a N .表达质粒转化大肠杆菌BL2 1 (DE3) ,并用IPTG诱导后 ,获得了高表达N蛋白的重组菌株 .目的蛋白经一步金属离子螯合层析纯化后获得了纯度超过 90 %的样品 .Western印迹及ELISA分析表明 ,SARS患者体内有特异性的针对N蛋白的抗体 ,并具有较高的特异性 .这为临床上诊断SARS患者提供了新方法 ,并为SARS疫苗的研制提供了研究思路     

SARS病毒与其他冠状病毒的基因组比较

本文利用生物信息学方法比较SARS病毒和其他冠状病毒基因组。通过数据库搜索,找出与SARS病毒基因组相似的核酸或蛋白质序列,并对相似序列进行比对,分析它们的共性和差异。结果表明,SARS病毒在基因组的组织上及结构蛋白质方面与现有冠状病毒有比较大的相似性,SARS病毒基因组与冠状病毒基因组相关。但是,SARS病毒基因组还存在一些特异性序列,ORF1a和S蛋白(特别是S1)的变化以及SARS—CoV特异性的非结构蛋白可能是SARS发病机理与传染特性区别于其他冠状病毒的分子基础。在全基因组水平上进行核酸单词出现频率分析,结果表明,SARS病毒远离已知的其他冠状病毒,单独成为一类。     

中国科学家完成SARS病毒基因克隆和主要蛋白的表达

中国科学家已成功克隆SARS病毒的 6个主要蛋白基因 ,完成SARS病毒中 3个主要蛋白的表达。这是继SARS病毒分离成功和病毒全基因组测序成功之后 ,科学家对SARS病毒研究取得的又一重要阶段性成果。中国科学院上海生命科学研究院院长裴钢 5月 16日宣布 :经过联合攻关 ,研究人员成功     

SARS病毒与其他冠状病毒的基因组比较

本文利用生物信息学方法比较SARS病毒和其他冠状病毒基因组.通过数据库搜索,找出与SARS病毒基因组相似的核酸或蛋白质序列,并对相似序列进行比对,分析它们的共性和差异.结果表明,SARS病毒在基因组的组织上及结构蛋白质方面与现有冠状病毒有比较大的相似性,SARS病毒基因组与冠状病毒基因组相关.但是,SARS病毒基因组还存在一些特异性序列,ORF1a和S蛋白(特别是S1)的变化以及SARS-CoV特异性的非结构蛋白可能是SARS发病机理与传染特性区别于其他冠状病毒的分子基础.在全基因组水平上进行核酸单词出现频率分析,结果表明,SARS病毒远离已知的其他冠状病毒,单独成为一类.     

SARS病毒S蛋白三维结构预测

蛋白质结构类型识别方法可以在没有序列同源性的蛋白质之间检测有没有结构相似性。利用蛋白质结构类型识别方法预测了SARS病毒S蛋白N端区域的结构。模建的SARS病毒S蛋白N端区域是一个全折叠的结构。     

通过反向遗传操作技术构建传染性支气管炎病毒nsp15核酸内切酶活性缺陷型重组毒株

传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)属于γ属冠状病毒,其核酸内切酶nsp15(Non-structural protein 15)的功能尚未得到解析.为探讨nsp15在IBV感染和复制过程中的作用,本研究对nsp15的核酸内切酶活性中心H238进行突变,通过体外连接技术构建重组病毒rIBV-nsp15-H238A,并对病毒滴度、感染复制能力和生长曲线进行鉴定.方法 如下:将IBV Beaudette-R毒株的基因组分成5个片段克隆到质粒载体,并在每个片段加上BsaI或BsmBI限制性酶切位点.通过质粒载体进行扩增后,通过酶切获得cDNA片段,在体外连接成全长基因组cDNA,转录出全长基因组RNA,跟N的转录本一起电击转染到Vero细胞,拯救出重组病毒rIBV和rIBV-nsp15-H238A.利用空斑试验检测比较rIBV和rIBV-nsp15-H238A的病毒滴度和空斑大小,鉴定nsp15核酸内切酶活性对IBV感染性的影响.结果 显示,rIBV-nsp15-H238A的病毒滴度为2.7×106PFU/mL,比rIBV的病毒滴度(9.4×106PFU/mL)低3倍还多,且rIBV-nsp15-H238A空斑孔径远小于rIBV,说明rIBV-nsp15-H238A复制和扩散能力远低于rIBV.利用TCID50检测病毒的生长曲线,结果表明在感染后0～24h,rIBV-nsp15-H238A的生长曲线均低于rIBV.由此可见,IBV nsp15H238核酸内切酶活性位点对IBV的感染复制起着重要作用.本研究通过反向遗传操作构建nsp15核酸内切酶活性缺陷型重组病毒,为研究nsp15的功能提供了一个有力的工具.     

中科院完成SARS病毒重要蛋白基因克隆和表达

中国科学院上海生命科学院日前宣布 ,药物所、生化与细胞所的科学家已实现对 SARS病毒 6种主要蛋白基因的克隆 ,并完成其中 3个关键蛋白的表达 ,1种蛋白已开始应用于抗 SARS病毒药物的体外筛选。有关这些工作的学术论文已被 SCI期刊《中国药理学报》接受。这些工作标志着我国科学家在认识和征服 SARS病毒的道路上取得重要进展 ,对 SARS病毒的生物学功能研究 ,特别是对研制抗 SARS病毒疫苗和药物 ,以及 SARS病原学研究都将产生重大推进作用。在 SARS病毒对人体构成感染的过程中起重要作用的蛋白质已被发现有 6种 :E蛋白、S蛋白…