猪流行性腹泻病毒nsp1蛋白对Ⅰ型干扰素应答的影响

猪流行性腹泻病毒 (PEDV) 能抑制宿主Ⅰ型干扰素及其诱导的细胞抗病毒免疫应答,但是PEDV抑制Ⅰ型干扰素应答的分子机制尚不明了,尤其是PEDV非结构蛋白 (Nonstructural proteins,nsps) 在Ⅰ型干扰素应答中的调控作用研究不多。为研究PEDV非结构蛋白1 (nsp1) 对细胞Ⅰ型干扰素应答的影响,构建了真核表达载体pCAGGS-nsp1,采用Western blotting和间接免疫荧光试验确定nsp1在细胞中的表达。通过报告基因法、ELISA以及病毒复制抑制试验评估nsp1对Ⅰ型IFN的影响。结果显示,nsp1在转染细胞和病毒感染细胞中均高效表达;双荧光报告基因试验结果表明,nsp1能显著抑制IFN-β启动子活性,且具有剂量依赖性。ELISA结果显示,nsp1能显著抑制IFN-β蛋白的表达。水泡性口炎病毒 (VSV) 复制抑制试验结果显示,nsp1明显抑制poly(I:C)介导的Ⅰ型IFN的抗病毒作用。结果提示,nsp1作为PEDV的保守蛋白,具有拮抗Ⅰ型干扰素启动子活性和应答的功能,为揭示PEDV逃逸宿主天然免疫应答的机制和研发新型高效抗PEDV疫苗奠定基础。     

汉坦病毒感染对Ⅰ型干扰素应答的调节机制

汉坦病毒主要感染人内皮细胞,细胞在病毒感染早期诱导生成的Ⅰ型干扰素(IFN-Ⅰ)可阻断汉坦病毒的复制,但不同的病毒蛋白和不同型别的汉坦病毒在IFN应答的调节机制上可能有所不同。就汉坦病毒感染对IFN应答的调节机制进行了综述。     

口蹄疫病毒结构蛋白VP0抑制Ⅰ型干扰素信号通路的激活

【目的】研究口蹄疫病毒(FMDV)结构蛋白VP0对Ⅰ型干扰素信号通路的影响。【方法】通过反转录PCR构建VP0真核表达载体,利用Western blotting验证VP0蛋白转染HEK-293T细胞后的表达情况;Real-time PCR检测VP0蛋白对FMDV在BHK细胞上复制的影响,检测VP0蛋白对SeV诱导的干扰素信号通路分子RIG-I、IRF3、IFN-β及下游刺激基因ISG15、ISG20表达的影响;双荧光素酶报告基因检测系统检测VP0蛋白对SeV诱导的IFN-β和NF-κB启动子激活以及对RIG-I样受体(RIG-I-like receptors,RLRs)信号通路分子激活IFN启动子的影响;免疫共沉淀检测VP0蛋白与RLRs信号通路中关键分子的相互作用。【结果】成功构建了p CAGGs-VP0真核表达载体,可以在HEK-293T细胞中表达;FMDV感染后的4–6 h,VP0蛋白显著促进FMDV在BHK细胞上的复制(P0.01或P0.05);VP0蛋白明显抑制干扰素下游刺激基因的表达(P0.01或P0.05)。在双荧光素酶报告基因检测实验中,VP0蛋白抑制SeV诱导IFN-β和NF-κB的活化具有剂量依赖性(P0.01),并对RIG-I、MDA5、VISA、TBK1和IRF3介导的IFN-β产生具有抑制作用,但是对IRF7没有明显的影响。免疫共沉淀显示VP0蛋白可与IRF3发生相互作用。【结论】证实VP0蛋白可以通过与IRF3相互作用来抑制Ⅰ型干扰素信号通路的激活。     

干扰素系统与病毒的相互作用

干扰素是最早发现的细胞因子之一,不同类型的IFN生物活性基本相同,具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等作用。病毒侵染细胞,诱导细胞产生IFN,IFN通过不同的作用机制启动宿主防御系统,激活酶和作用因子来拮抗病毒的侵染、复制和转录过程。正因为干扰素在抗病毒防御过程中的关键作用,因此病毒已经衍生出了有效的方式能够成功的侵染宿主。病毒通过表达一些拮抗蛋白来干扰IFN的诱导产生、IFN的信号转导或效应蛋白的作用,从而终止干扰素的产生并破坏干扰素诱导的其它因子的作用来逃避干扰素的作用。     

犬干扰素-γcDNA的克隆及其在鼠骨髓瘤细胞(SP2/O)中表达

干扰素(IFN)是由脊椎动物细胞产生的一类分泌型糖蛋白,它具有广谱抗病毒和增强免疫应答的作用[1].干扰素可分为Ⅰ型和Ⅱ型,Ⅱ型干扰素又称为干扰素-γ(IFN-γ)或免疫干扰素,主要由抗原刺激CD4+和CD8+T细胞所产生2].IFN-γ可使Mφ功能亢进,诱导产生特异性抗体,在免疫应答中十分重要[3].     

联合IFN-α与U0126的抗EV-A71作用及其机制研究

目的在细胞学水平明确IFN-α和胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)通路抑制剂U0126联合用药对肠道病毒A71(EV-A71)感染的作用及其可能机制。方法利用病毒致细胞病变效应、病毒终点滴定实验以及Western blot,确定IFN-α和U0126联合用药对EV-A71抗病毒效果,对细胞干扰素(interferon, IFN)受体及其下游信号通路重要蛋白水平、ERK通路活性的影响。结果 IFN-α和U0126联合用药能有效发挥抗EV-A71增殖的作用(P0.01),同时也能有效抑制ERK通路磷酸化活性、阻断EV-A71 2A~(pro)介导的I型干扰素受体1(interferon alpha receptor 1, IFNAR1)表达水平下调(P0.001),并上调IFN信号通路重要分子eIF2α磷酸化(P0.001)。此外,利用ERK抑制剂(U0126和sorafenib)或特异性siRNA分别阻断ERK磷酸化活性后,可显著阻断肠道病毒2A~(pro)介导的eIF4GI切割和IFNAR1表达下调的作用,同时受染细胞EV-A71复制也显著下降。结论 IFN-α和U0126联合用药可通过有效地抑制ERK通路,抑制2A~(pro)依赖的切割eIF4GI和下调IFNAR1表达的作用,使得外源IFN-α能更有效与细胞膜上IFNAR结合,有效激活IFN抗病毒信号通路,从而发挥IFN抗EV-A71蛋白翻译及增殖作用。     

猪流行性腹泻病毒与宿主抗病毒天然免疫抑制

猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)能引起猪腹泻等肠道疾病,属于α属冠状病毒,它的爆发给很多国家养猪业造成了严重的经济损失。2010年以来,PEDV感染在中国出现大规模爆发,一种突变型PEDV也于2013年在美国出现并迅速传播。 RNA病毒能够通过Toll样受体通路3（TLR3）和RIG-I样受体通路（RLR）诱导I型干扰素的产生。但以往的研究表明,PEDV感染能抑制I型干扰素的合成。近年来有关PEDV调节宿主天然免疫应答的研究取得了很大进展。PEDV主要通过编码作为干扰素拮抗剂的病毒蛋白以及隐藏病毒自身病原相关分子模式（PAMP）等两种方式逃逸宿主天然免疫应答。目前已报道,PEDV非结构蛋白1可通过降解CBP阻碍干扰素调节因子3(IRF-3)组装成增强子复合体;木瓜蛋白酶样蛋白酶可通过其去泛素化酶活性阻断天然免疫信号通路传递;3C样蛋白酶可通过剪切NEMO发挥干扰素拮抗剂活性;核衣壳蛋白通过结合TBK1抑制I型干扰素产生。PEDV也可通过合成加帽酶隐藏其病原相关分子dsRNA来避免激活天然免疫通路。PEDV抗病毒天然免疫机制阐明为研究PEDV感染免疫和致病机制提供了重要的理论依据,为研发抗PEDV新型疫苗和药物提供了基础。     

MxA蛋白抗病毒机制及其应用前景

本文主要论述了MxA基因在Ⅰ型干扰素(IFN-α/β)或病毒诱导下可表达具广谱抗病毒作用的Mx蛋白(小鼠为Mx1,人类为MxA),并介绍了MxA蛋白的抗病毒谱及其机制,论述了MxA表达与病毒(HIV-1、HBV、HCV等)感染性疾病发生和发展的相关性,以及在判定IFN疗效中的应用.既有理论意义,又有广阔的应用前景.     

口蹄疫病毒结构蛋白VP0抑制I型干扰素信号通路的激活

[目的]研究口蹄疫病毒（FMDV）结构蛋白VP0对I型干扰素信号通路的影响。[方法]通过反转录PCR构建VP0真核表达载体,利用Western blotting验证VP0蛋白转染HEK-293T细胞后的表达情况;Real-time PCR检测VP0蛋白对FMDV在BHK细胞上复制的影响,检测VP0蛋白对SeV诱导的干扰素信号通路分子RIG-I、IRF3、IFN-β及下游刺激基因ISG15、ISG20表达的影响;双荧光素酶报告基因检测系统检测VP0蛋白对SeV诱导的IFN-β和NF-κB启动子激活以及对RIG-I样受体（RIG-I-like receptors,RLRs）信号通路分子激活IFN启动子的影响;免疫共沉淀检测VP0蛋白与RLRs信号通路中关键分子的相互作用。[结果]成功构建了pCAGGs-VP0真核表达载体,可以在HEK-293T细胞中表达;FMDV感染后的4-6 h,VP0蛋白显著促进FMDV在BHK细胞上的复制（P<0.01或P<0.05）;VP0蛋白明显抑制干扰素下游刺激基因的表达（P<0.01或P<0.05）。在双荧光素酶报告基因检测实验中,VP0蛋白抑制SeV诱导IFN-β和NF-κB的活化具有剂量依赖性（P<0.01）,并对RIG-I、MDA5、VISA、TBK1和IRF3介导的IFN-β产生具有抑制作用,但是对IRF7没有明显的影响。免疫共沉淀显示VP0蛋白可与IRF3发生相互作用。[结论]证实VP0蛋白可以通过与IRF3相互作用来抑制I型干扰素信号通路的激活。     

新型猫源干扰素FeIFN-ω与干扰素FeIFN-α的表达及抗病毒活性比较

ω型干扰素(IFN-ω)与α型干扰素(IFN-α)同属于Ⅰ型干扰素,都具有抗病毒,抗增殖和免疫调节的功能,但它们之间的活性却存在较大差异.通过PCR扩增猫ω型干扰素基因(FeIFN-ω),根据GenBank公布的猫α型干扰素基因序列,合成猫α型干扰素基因(FeIFN-α).分别构建原核表达载体pET-His/FeIFN-α和pET-His/FeIFN-ω,转化大肠杆菌Rosetta(DE3)进行表达.表达产物经Ni-NTA亲和层析纯化,复性后蛋白用细胞病变抑制法进行抗病毒活性测定.结果显示,重组猫ω型干扰素(FeIFN-ω)抗病毒活性明显高于重组猫α型干扰素(FeIFN-α),尤其对H9N2亚型禽流感病毒(AIV),FeIFN-ω的活性是FeIFN-α的160倍,对犬瘟热病毒(CDV),FeIFN-ω的活性是FeIFN-α的4倍,而日本同类产品Intercat 对CDV和AIV均未表现活性.以上研究为以ω型干扰素为基础的抗病毒药物应用奠定了重要的理论基础.     

基于GEO数据分析的猪病毒源siRNA

RNA干扰（RNA interference,RNAi）是宿主细胞抗病毒的关键方法之一，其核心切割酶Dicer会将病毒复制过程中产生的双链RNA切割成长度为21-23 nt小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)。病毒源siRNA可直接靶向降解病毒的mRNA，阻断病毒复制。本研究一方面筛选NCBI GEO(National Center for Biotechnology Information Gene Expression Omnibus)数据库中有关猪病毒感染后产生的小RNA序列，分析比对病毒vsiRNA以探讨vsiRNA数量和其在病毒基因区域的存在规律。研究结果表明RNAi系统中Dicer对正链RNA病毒有一定的切割偏好性，并且可以识别与切割DNA病毒转录过程中产生的双链RNA。另一方面，本研究发现猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）感染猪骨髓源树突状细胞后，宿主细胞的IFN-α、IFN-β与Dicer的表达量均显著下调，表明PEDV通过抑制IFN及RNAi的产生来实现免疫逃避。综上，本研究以...     

猪流行性腹泻病毒非结构蛋白nsp9互作宿主蛋白对病毒复制的影响

猪流行性腹泻病毒(porcineepidemicdiarrheavirus,PEDV)导致仔猪和育肥猪发生急性肠道传染病，是危害养猪业最重要的病原体之一。目前发现PEDV能够编码至少16个非结构蛋白，其中nsp9能够结合至单链RNA中，但是其功能机制还不清楚。本研究通过免疫沉淀联合蛋白质谱分析，筛选出潜在的与PEDV nsp9宿主互作蛋白。通过进一步免疫共沉淀(co-immunoprecipitation, Co-IP)和激光共聚焦技术确认了nsp9与热休克蛋白HSPA8、Toll相互作用蛋白Tollip、热休克蛋白HSPA9、线粒体外膜蛋白TOMM70互作。其中，过表达HSPA8使nsp9的表达量先上调而后下调，并促进PEDV的增殖；过表达Tollip使nsp9的表达量显著上调，并抑制PEDV的增殖；过表达TOMM70使nsp9的表达量显著下调，但对PEDV的增殖无明显影响；过表达HSPA9对nsp9的表达以及PEDV的增殖均无明显影响。该研究为探索nsp9互作蛋白在PEDV感染过程中的功能提供了重要信息。     

Ⅰ型干扰素免疫应答作用机制研究进展

I型干扰素(IFN-Ⅰ)是机体固有免疫应答的一类重要的细胞因子,具有广谱的抗病毒及抗肿瘤等作用。近年来IFN-Ⅰ成为病毒学、疫苗学及肿瘤学等研究的热点,对干扰素诱导基因(ISGs)的功能研究进一步揭示了其抗病毒以及抗肿瘤的作用机制。麻疹病毒、流感病毒和肠道病毒71型等病毒均可通过与IFN-Ⅰ或其上、下游调节因子结合阻断IFN-Ⅰ信号通路,从而逃逸IFN-Ⅰ的抗病毒作用,这对病毒性疾病的防治是新的挑战。近期研究发现IFN-Ⅰ是疫苗诱导抗体产生的必要信号,同时参与调节T、B细胞的活化过程,在免疫应答过程中发挥关键作用。对IFN-Ⅰ免疫应答作用机制研究进行了综述。     

ANXA1促进Ⅰ型干扰素表达抑制口蹄疫病毒的复制

【目的】研究膜联蛋白A1(Annexin A1,ANXA1)对Ⅰ型干扰素(I-IFN)表达及口蹄疫病毒(FMDV)复制的影响。【方法】开展过表达及Knockdown实验,检测ANXA1对FMDV复制的影响。利用双荧光素酶报告系统检测ANXA1对ISRE和IFN-β启动子元件活化的影响。双荧光素酶报告系统鉴定ANXA1调控Ⅰ-IFN通路活化靶分子。Western blotting检测ANXA1对干扰素调解因子3(IRF3)磷酸化的影响。Real-time PCR检测ANXA1对干扰素刺激基因(ISGs)的影响。【结果】过表达ANXA1显著抑制FMDV的复制;下调ANXA1表达促进FMDV复制(P0.01或P0.05);ANXA1促Ⅰ型干扰素通路活化,呈现剂量依赖性(P0.01)。ANXA1显著增强IRF3的磷酸化,促进ISGs的表达(P0.01或P0.05)。【结论】ANXA1促进Ⅰ-IFN表达,抑制FMDV的复制。     

不同来源人肝细胞系β干扰素诱生及其信号通路的比较

β干扰素(IFN-β)是一种在抗病毒固有免疫应答过程中具有重要作用的细胞因子,而肝细胞作为肝炎病毒的宿主细胞被认为具有IFN-β诱生的能力,但目前尚未建立合适的体外人肝细胞模型用以研究乙型肝炎病毒(HBV)与肝细胞干扰素系统的相互作用。为此,本研究选取了3株人肝细胞系PH5CH8、Huh7、HepG2作为研究对象,以IFN-β诱生剂新城疫病毒(NDV)与多聚次黄苷酸-胞苷酸〔poly(I∶C)〕处理细胞,从转录、蛋白水平及功能学角度检测产生IFN-β的能力。结果显示,与Huh7和HepG2细胞相比,PH5CH8细胞经NDV与poly(I∶C)诱导可产生高水平的IFN-β。进一步利用蛋白免疫印迹法比较3株细胞系内IFN-β诱生信号通路相关蛋白的表达水平,结果显示,与PH5CH8细胞相比,Huh7和HepG2细胞内多种信号蛋白的表达水平偏低。本研究结果为选择合适肝细胞系用于HBV与干扰素系统作用的研究提供了实验依据,并为重建IFN诱生系统选择性缺陷的肝细胞系提供了理论基础。     

表达猪瘟病毒E2蛋白的BacMam病毒的构建及其免疫原性分析

含具有哺乳动物细胞活性的启动子的重组杆状病毒(BacMam病毒)可有效转导多种哺乳动物细胞,并被广泛用于开发新型非复制型载体疫苗．将水泡性口炎病毒G蛋白(VSV-G)基因插入多角体启动子下游,得到经修饰的杆状病毒转移载体,将对虾白斑综合症病毒(WSSV)ie1启动子控制下的猪瘟病毒E2基因表达盒插入此载体中,构建了BacMam病毒BacMam/G-ie1-E2,以其感染Sf9细胞和转导HeLa细胞,通过间接免疫荧光试验和Western blot分析检测E蛋白的表达,同时用BacMam病毒直接免疫小鼠,用检测猪瘟病毒抗体的间接ELISA方法检测免疫小鼠血清抗体,用基于CFSE和WST-8的淋巴细胞增殖试验评价其细胞免疫应答．结果显示,BacMam/G-ie1-E2能同时在昆虫细胞和哺乳动物细胞中高效表达E2蛋白,免疫小鼠能诱导产生针对猪瘟病毒的特异性抗体,免疫小鼠脾细胞经猪瘟病毒刺激后能诱导特异性的淋巴细胞增殖．这表明,由BacMam病毒介导的基因转移有望用于开发针对猪瘟病毒的非复制型载体疫苗．     

HIV-1感染诱导丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Citron kinase上调机制研究

HIV-1感染可以改变宿主细胞的表达谱,上调和病毒转录复制翻译包装所需的宿主蛋白,使宿主变成更加适应病毒复制繁殖的环境。研究表明丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Citron kinase(citK)可以促进HIV-1病毒的包装释放,所以我们在本文中进一步探讨了HIV-1感染对Citron kinase在自然生理状态下的表达是否有调节作用。我们用含有荧光素酶报告基因的HIV-1假病毒感染外周血单个核细胞(PBMC)和HEK293T细胞系,检测Citron kinase表达的上调情况。此外,将Citron kinase的上游启动子克隆入含荧光素酶报告基因的载体上,检测HIV假病毒感染对Citron kinase启动子的影响。结果显示:HIV-1可以显著提高PBMC细胞中Citron kinase的表达量,而Citron kinase为HIV-1复制包装所需。在原代CD4+T细胞中过表达Citron kinase,HIV-1的复制可以提高2倍以上。沉默Citron kinase的表达,HIV-1病毒产生量显著降低。在HEK293T细胞系中,HIV-1假病毒感染可以使Citron kinase的mRNA的水平提高2.5倍,蛋白表达量提高2.7倍。我们通过将Citron kinase的启动子克隆到含有荧光素酶报告系统的载体上,感染HIV-1假病毒,发现荧光素酶的活性增加。这提示着HIV-1感染通过转录水平上调Citron kinase的表达,从而为病毒创造复制繁殖更有利的宿主环境。     

Ⅲ型干扰素——新型抗病毒细胞因子

干扰素（IFN）是抗病毒感染的第一道防线,Ⅰ型和Ⅱ型干扰素不仅可抑制病毒,而且还能参与天然免疫反应和获得性免疫反应。最近干扰素家族增添一位新成员：Ⅲ型干扰素,即IFN-λ,因其具有类似干扰素的抗病毒活性且能诱导干扰素相关基因的表达而命名。IFN-λ受体与Ⅰ型干扰素的受体不同,但具有与Ⅰ型干扰素类似的诱导表达方式和信号转导通路,并能激活一系列相似的干扰素刺激基因。就IFN-λ家族及其受体、基因表达和信号转导机制、抗病毒作用等进行综述。     

HPV16 E6蛋白在宫颈癌中的作用研究进展

高危型人乳头状瘤病毒16型(HPV16)与50%以上的宫颈癌密切相关,其E6癌蛋白作为病毒生命周期的主要蛋白之一,在诱导肿瘤发生与发展进程中起重要作用,且与病毒复制、宿主细胞周期调控、细胞凋亡、细胞增殖、细胞恶性表型转化有关。E6蛋白主要作用包括:通过结合E6相关蛋白降解P53抑制细胞凋亡;增强端粒酶活性使宿主细胞永生化;与Daxx启动子区结合,抑制启动子转录活性,降低Daxx蛋白表达,阻遏细胞凋亡;与多种细胞因子相互作用后,经多种途径改变细胞微环境,使之有利于肿瘤细胞逃避宿主固有免疫应答。因此,在宫颈癌的发生和发展中,HPV16 E6蛋白通过多种作用机制发挥重要作用。     

HSP27过表达抑制脑心肌炎病毒复制的作用初探

已有研究表明,HSP27在一些病毒的生命周期中发挥着重要作用,但它对于脑心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus,EMCV)的调控作用尚不明晰。该研究通过构建人源HSP27的表达质粒pCMV-Myc-HSP27并于HEK293细胞中表达后,接种EMCV检测病毒的复制及相关通路蛋白表达情况。结果显示,过表达HSP27可以抑制EMCV在宿主细胞中的复制,进一步分析表明,HSP27可能是通过正调控IFN-β信号通路中接头分子MAVS、TBK1、IRF3的表达和阻止自噬体与溶酶体的融合实现对EMCV复制的负调控作用。总之,该研究首次表明,HSP27抑制EMCV复制是通过IFN-β信号通路及自噬途径来实现的,这些发现为揭示EMCV感染中宿主因子的调控作用和潜在的抗病毒靶点提供新的见解。