重组SARS病毒N蛋白可与SARS患者血清发生特异反应

N蛋白是SARS CoV病毒基因组编码病毒核衣壳蛋白 ,它不同于现已知的任何蛋白质 .对它的深入研究对揭示SARS -CoV的致病机理和疫苗及诊断试剂的研制有重要意义 .灭活的病毒经逆转录后 ,用根据已知的病毒的基因组序列所设计的引物PCR扩增N蛋白基因 .扩增出的基因经序列分析表明和已知的序列完全一致 ,共编码 4 2 2个氨基酸残基 .将N蛋白基因克隆入原核表达载体pET2 8a构建成表达质粒pET2 8a N .表达质粒转化大肠杆菌BL2 1 (DE3) ,并用IPTG诱导后 ,获得了高表达N蛋白的重组菌株 .目的蛋白经一步金属离子螯合层析纯化后获得了纯度超过 90 %的样品 .Western印迹及ELISA分析表明 ,SARS患者体内有特异性的针对N蛋白的抗体 ,并具有较高的特异性 .这为临床上诊断SARS患者提供了新方法 ,并为SARS疫苗的研制提供了研究思路     

6-溴异香兰素BVAN08诱发肝癌细胞HepG2纺锤体损伤和有丝分裂灾变死亡

研究香兰素衍生物中的6.溴异香兰素(BVAN08)对细胞纺锤体结构的影响及诱发灾变死亡的相关机制,为开发该化合物为新的抗癌药物提供理论依据.通过光学显微镜观察BvAN08作用后细胞形态学变化,流式细胞术检测细胞周期,纺锤体功能检测点实验和原位免疫荧光杂交实验分析细胞有丝分裂进程和纺锤体结构.western印记检测BVAN08作用后相关蛋白质的变化.结果表明20～60 μmol/L BVAN08作用后,HepG2细胞变圆不再贴壁生长、随后脱落死亡,具有浓度依赖性量效关系;明显诱导细胞G2/M期阻滞、导致细胞有丝分裂指数升高,并出现大量的非二倍体和多倍体细胞;破坏细胞纺锤体的结构,多中心体细胞显著增加;该化合物促使细胞周期转录调节因子FoxM1及其下游靶分子细胞周期蛋白B1和CdK1的降解、阻止有丝分裂过程而导致有丝分裂灾变死亡.研究揭示BVAN08通过破坏纺锤体结构、诱发M期阻滞,导致细胞有丝分裂灾变死亡,FoxM1失活可能参与其作用机制.     

重组人载脂蛋白AI米兰突变体在大肠杆菌中的高表达

用RT-PCR法从人肝总RNA库中克隆出人载脂蛋白Al的cDNA序列,再通过重叠PCR将载脂蛋白AI的第179位精氨酸密码子突变成半胱氨酸密码子,即载胎蛋白AI米兰突变体基因。将此目的基因克隆至表达载体pQE30,重组质粒转化JMl09宿主菌,经表达试验筛选出高表达克隆;工程菌经诱导后表达出含6个氨基酸前肽的载脂蛋白AI米兰突变体。表达产物主要以可溶形式存在,但也有部分为包涵体。     

从大容量噬菌体抗体库中筛选抗DNA-PKcs单链抗体

目的：从单链大容量噬菌体抗体库中筛选特异性的抗DNA-PKcs的人源抗体,用于肿瘤治疗或诊断目的。方法：经抗原性分析及BLAST比对,选定人DNA-PKcs蛋白中抗原性高且与其他蛋白没有同源性的片段,进行原核表达及纯化后将其固定在抗原管上,通过4轮“吸附－洗脱－扩增”过程从大容量抗体库中筛选特异性抗体,转化HB2151菌,制备抗DNA-PKcs的可溶性单链抗体;ELISA检测抗原-抗体结合活性。结果：经生物信息学分析,确定抗原性高且与其他蛋白没有同源性的DNA-PKcs片段DPK3（250个AA）、DPK4（257个AA）。经过4轮筛选,获得26个特异性结合DPK3及31个特异结合DPK4的克隆,指纹分析分别有5种和21种不同的可变区片段;成功制备了可溶性抗体。并做了抗原结合活性鉴定。结论：利用单链大容量抗体库获得抗DNA-PKcs的噬菌体抗体基因并且成功制备成可溶性抗体,为今后的研究和应用奠定了基础。     

乙酰基转移酶Tip60(KAT5)的功能研究进展

Tip60(KAT5)属于MYST乙酰基转移酶家族,同时它也是进化上非常保守的Nu A4蛋白质复合体的重要成员.过去十几年的研究证实,Tip60一方面可以作为转录调控因子结合核受体(如雄激素受体,AR)或c-MYC、AICD/Fe65、NCo R、E2F等转录因子来激活或抑制下游基因的表达,另一方面,KAT5可以乙酰化一系列蛋白来调控这些蛋白质的活性及稳定性,进而调控DNA损伤修复反应、细胞周期进程、细胞周期检查点的激活、凋亡、代谢及自噬等重要细胞功能.此外,Tip60在肿瘤的发生发展及转移、胚胎发育等过程中也发挥着至关重要的作用.本文将主要对Tip60近几年的研究进展做一个综述.     

重组人载脂蛋白AI米兰突变体在大肠杆菌中的可溶性表达

载脂蛋白AI米兰突变体(apoliproteinA-I-Milano ,AIM)是载脂蛋白AI的天然突变体,具有比载脂蛋白AI更强的抗动脉粥样硬化症的作用。将AIM基因N_末端的氨基酸密码子优化后,克隆至表达载体pET2 2b ,重组质粒转化BL2 1(DE3)宿主菌,用IPTG诱导表达。AIM以可溶形式表达,约占菌体总蛋白的38%。表达产物经ButylSepharose 4F .F疏水层析和QSepharoseH .P .阴离子交换层析后,再用Vivaspin2 0 (30 0 0 0MW)进行超滤,AIM单体的纯度达95 %以上。AIM单体与脂结合活性表明,AIM单体结合脂的速度比apoA_I慢,但结合脂的量比apoA_I高。这项研究为AIM的结构和功能,特别是临床应用研究奠定了基础。     

一种基于GFP分子荧光显示的检测大尺度染色质松弛技术的建立

在真核生物中,基因组DNA是被高度包装成染色质的形式而存在的,这就对基因在复制、转录、修复、重组时的功能分子有效地接近DNA形成了天然屏障,执行上述生化反应需要松散染色质的结构,染色质松散是染色质动态变化即染色质重塑(chromatin remodeling)的一种形式.越来越多的证据表明,染色质重塑在DNA损伤反应中起着非常重要的作用,染色质重塑过程可以把损伤应答和修复蛋白募集到损伤位点,从而完成修复.为了进一步探讨染色质重塑和DNA损伤修复的偶联机制,采用了基于Lac抑制子和Lac操纵子的大规模染色质重塑报告系统,并借助GFP分子荧光显示方法,建立了可以直观地观察染色质松散的技术.在利用该技术证实了DNA损伤应答蛋白TIP60能够强烈诱导染色质松散的基础上,发现P53诱导基因3蛋白(PIG3)在细胞辐射DNA损伤反应中也能够一定程度地诱导染色质松弛.这些结果证明此技术是可靠的,也为阐述DNA损伤修复与染色质重塑关联机制提供了新的信息.     

热休克蛋白gp96作为抗原载体的研究进展

gp96是存在于真核生物细胞内质网中的分子量约为96kD的热休克蛋白(又称GRP94)。它属于HSP90家族,是胞质HSP90的旁系同源蛋白。研究证实从小鼠肿瘤组织中分离的gp96注射小鼠后,可使小鼠获得针对该肿瘤细胞的特异细胞免疫力。随后发现这种特异性免疫不是由gp96引起,而是由其结合的小肽诱发。gp96受体的发现给这种现象的解释提供了线索。人们提出了多种假说来解释这种现象,其中一些得到了广泛的支持。另外,gp96还参与免疫调节过程。完全了解gp96在免疫系统中的作用机制对开发新型药物如肿瘤和病毒感染治疗性疫苗具有重要意义 。