AFP基因细胞专一性的表达依赖于某些核蛋白

Southern blotting分析没有发现成年大鼠肝、胚肝及肝癌细胞AFP基因5′端及上游有任何不同。以AFP基因转录起始点到5′端上游255 bp DNA片段为探针进行Southwestern blotting分析,发现表达AFP基因的细胞核蛋白中存在与其结合的核蛋白,这些在成年大鼠肝、肺、脾、心和肾细胞核蛋白中不存在。含有结合蛋白的肝癌核蛋白部分能使作为RNA聚合酶Ⅱ来源的成年大鼠肝细胞核蛋白部分具备较高的体外转录活性,表明基因细胞专一的表达确与某些结合蛋白有关。     

肝癌细胞AFP基因高水平的转录是受核蛋白成分的促进

利用大鼠甲胎蛋白(AFP)基因片段作为模板,分析大鼠肝癌细胞核蛋白成分对体外转录活性的影响,发现大鼠肝癌含有促进AFP基因体外转录的核蛋白。作为对照．没有发现任何成年大鼠肝核蛋白可以促进AFP基因的体外转录。为了确定促进AFP基因体外转录的核蛋白作用部位,对AFP基因模板5＇端上游序列进行了不同程度的删除,进一步分析核蛋白对删掉5’端上游序列后的模板体外转录的影响,结果表明,AFP基因转录的起始点到255bp这段DNA序列是大鼠肝癌核蛋白促进AFP基因转录必不可少的。以SV40DNA经Pst I酶酶切所得的DNA片段(1216bp和4027bp)代替AFP基因片段作为模板,不存在核蛋白促进体外转录的现象。用AFP基因转录的起始点到 255bp这段的DNA为探针,进行Southwestm印迹分析,结果发现了8种与探针结合的核蛋白。     

人分裂细胞核抗原基因片段的筛选、测序及对启动子的分析

经６．６×１０５个克隆筛选,从装在λ噬菌体载体Ｃｈａｒｏｎ３０中的人基因库中筛选到了一个含人分裂细胞核抗原（ＰＣＮＡ）基因的克隆。经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析插入基因长约１４ｋｂ,有较长的５＇上游区,但３＇端缺少一部分。经亚克隆和测序已确定从５＇上游１２６３ｂｐ到３＇端与λ载体接点共４９６９ｂｐＰＣＮＡ基因片段的核苷酸序列。将ＰＣＮＡ基因启动子核苷酸序列与ＤＮＡ聚合酶α,拓扑异构酶Ⅱα,胸苷酸激酶基因的启动子进行比较有３０％以上同源性,具有“看家基因”特征。在转录起始点的５＇上游几百ｂｐ的范围内都有与ＣＡＴ,ＳＰ１,Ｅ２Ｆ,ＮＦＨＢ,Ｏｃｔ１和ＡＴＦ等转录因子的结合位点相似的核苷酸序列。     

大鼠诱导型一氧化氮合酶基因转录调控区的克隆与鉴定

采用单特异引物ＰＣＲ克隆法,得到大鼠诱导型一氧化氮合酶（ｉＮＯＳ）基因转录调控区ＤＮＡ片段。核酸序列分析证实,大鼠ｉＮＯＳ基因的５＇－侧翼区含有ＩＦＮ－γ和ＴＮＦ－α应答元件及ＮＦ－ｋＢ结合位点的保守序列。这些保守序列的位置及排列显区别于人和小鼠的ｉＮＯＳ基因。电泳迁移率改变分析（ＥＭＳＡ）表达,ＶＳＭＣ受ＩＬ－１和ＩＦＮ－γ刺激后,细胞核内产生某种可与ｉＮＯＳ基因５＇－侧翼区特异结合的核蛋白因     

大鼠诱导型一氧化氮合酶基因转录调控区的克隆与鉴定

采用单特异引物ＰＣＲ克隆法,得到大鼠诱导型一氧化氮合酶（ｉＮＯＳ）基因转录调控区ＤＮＡ片段．核酸序列分析证实,大鼠ｉＮＯＳ基因的５′－侧翼区含有ＩＦＮ－γ和ＴＮＦ－α应答元件及ＮＦ－κＢ结合位点的保守序列．这些保守序列的位置及排列显著区别于人和小鼠的ｉＮＯＳ基因．电泳迁移率改变分析（ＥＭＳＡ）表明,ＶＳＭＣ受ＩＬ－１和ＩＦＮ－γ刺激后,细胞核内产生某种可与ｉＮＯＳ基因５′－侧翼区特异结合的核蛋白因子．     

核蛋白成分参与胚胎肝细胞AFP基因的活化

利用体外转录分析方法,在大鼠胚胎肝细胞核蛋白中,检测到促进AFP基因转录的蛋白因子,用同样的方法在成年大鼠肝细胞核蛋白中没有检测到促进AFP基因转录的任何成分。DNA结合分析找到了可能为蛋白因子的核蛋白成分,它们的大小分别为89、50、46和36kDa。     

大鼠肝生长发育过程中ACP、AKP、HSC70/HSP68和PCNA的变化(英文)

磷酸酶（ＡＣＰ、ＡＫＰ）在生物的机能分化中起重要作用,热休克蛋白（ＨＳＰｓ）是近几年发现的一类在胚胎发育、细胞生存中起重要作用的分子,无论是胚胎发育还是细胞结构和功能构建都和细胞增殖密切相关,增殖细胞核抗原（ＰＣＮＡ）是检测细胞增殖的良好指标。 本实验用组织化学、免疫组织化学、Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹、酶的原位复性电泳、体视学分析等方法定性和定量分析了酸性磷酸酶（ＡＣＰ）（Ｆｉｇ．１＆２）、碱性磷酸酶（ＡＫＰ）（Ｆｉｇ．４＆５）、构成性热休克蛋白 ７０／诱导性热休克蛋白 ６８（ＨＳＣ７０／ＨＳＰ６８）（Ｆｉｇ．６）和ＰＣＮＡ（Ｆｉｇ．７＆８, Ｔａｂｌｅ１）在大鼠肝生长发育（从１４天胚胎到成体）过程中的动态变化。结果表明：（１）在大鼠肝生长发育过程中,ＡＣＰ有两个活性高峰期,其时段处于大鼠吃奶和吃饲料起始期（Ｆｉｇ．１＆２）;（２）在ＡＣＰ的第一个活性高峰期时,ＡＫＰ活性降低;而在ＡＣＰ的第二个活性高峰期时,正值ＡＫＰ的活性高峰期（Ｆｉｇ．３）;（３）ＡＣＰ活性高峰期也是ＰＣＮＡ含量高峰期;（４）ＨＳＣ７０／ＨＳＰ６８在刚断奶的幼鼠肝和成体肝中表达量较多,其他时段表达极少。根据上述结果推测：ＡＣＰ和ＰＣＮＡ通过调节细     

人淋巴毒素基因5′端上游NF－KB类因子特异性结合位点的研究

淋巴毒素（Ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ,ＬＴ）是由活化的Ｔ淋巴细胞分泌的一种糖蛋白。ＬＴ基因的表达调控主要是在转录水平上。ＰＨＡ＋ＰＭＡ诱导的Ｊｕｒｋａｔ细胞总ＲＮＡ点渍杂交发现,Ｊｕｒｋａｔ细胞的内源性ＬＴｍＲＮＡ的数量随诱导时间的延长而增加。凝胶迟滞电泳分析发现,ＰＨＡ＋ＰＭＡ诱导４小时的Ｊｕｒｋａｔ细胞核抽提物形成多种复合物,且在诱导不同时间后有明显变化。系列缺失片段的竞争反应表明,这些复合物的形成与ＬＴ基因５＇端上游──１２８ｂｐ──９３ｂｐ左右的序列相关。ＤＮａｓｅｌ足迹法及其竞争实验发现,ＬＴ基因５＇端上游─—１０４ｂｐ──８３ｂｐ（共２２ｂｐ）序列具有明显的蛋白质保护足迹。同源性分析发现此２２ｂｐ的序列中存在一个ＫＢ样结合位点：─１００ｂｐ──９０ｂｐ（５’－ＧＧＧＧＧＣＴＴＣＣＣ－３’）。ＮＰ－ＫＢ类蛋白质因子参与了此序列的ＤＮＡ－蛋白质的特异性结合,可能存在多种类型的ＮＰ－ＫＢ类蛋白因子参与了ＬＴ基因的表达调控。     

乙肝病毒表面抗原preS1与人肿瘤坏死因子α融合基因的表达

用ＰＣＲ法获得了ＨＢｓＡｇｐｒｅＳ１（１－６５）肽段基因,将该基因融合在肿瘤坏死因子（ｈＴＮＦα）之后,插入表达载体ＰＳＢ－９２中,使融合基因的５′端直接置于大肠肝菌ＰＬ启动子下游,采用３０℃培养,４２℃诱导,获得了ＴＮＦ与ｐｒｅＳ１（１－６５）融合蛋白的表达产物。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳显示表达产物为２５ｋＤ,约占细菌总蛋白的３５％。表达产物经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ验证,能分别特异地与ｈＴＮＦα抗体与ｐｒｅＳ１抗体结合,稀释复性后,该融合蛋白还具有ＴＮＦ的生理功能（对Ｌ９２９细胞的细胞毒活性）。经ＤＮＡ序列测定,ｐｒｅＳ１（１－６５）肽基因正确地融合在ｈＴＮＦα基因之后。该结果提供了一种制备ｐｒｅＳ１的新方法,为进一步开展治疗肝癌和乙肝的导向药物打下基础。     

人粒细胞集落刺激因子hG—CSF cDNA在大肠杆菌中表…

在不改变编码蛋白质氨基酸序列的前提下,利用合成ＤＮＡ接头的方法,在原始ｃＤＮＡ克隆基础上,构建了５＇端密码子富含ＡＴ的ｈＧ－ＣＳＦ ｃＤＮＡ突变体,使ｈＧ－ＣＳＦ ｃＤＮＡ得以在大肠杆菌中表达,但表达水平很低,借助相同的手段,在ｈＧ－ＣＳＦ ｃＤＮＡ ５＇端增加２４核苷酸对的ＦＬＡＧ肽编码序列,构建了ｈＧ－ＣＳＦ杂合蛋白（在ｈＧ－ＣＳＦ成熟蛋白Ｎ末端增加８氨基酸残基ＦＬＡＧ肽,二者结合点为肠激肽酶     

内含子的位置不影响转基因的表达

内含子在转基因动物的基因表达中具有重要作用,以乳清酸蛋白（ＷＡＰ）基因５′区为调控序列,人基因组Ｇ－ＣＳＦ基因为目的片段,将ＷＡＰ基因第一内含子插入Ｇ－ＣＳＦ基因５′端,构建成转基因动物乳腺表达载体。将其直接注射到小鼠乳腺,在泌乳期表达出人Ｇ－ＣＳＦ。表明内含子在５′端的位置不影响转基因的表达,同时也表明内含子对表达有一定的作用。     

人乳腺癌MCF-7细胞系凋亡过程中bcl-2基因的结合蛋白

 Ｍ Ｃ Ｆ ７ 是 ｐ５３ 为野生型的人乳腺癌细胞系．为探讨该细胞系凋亡过程中 ｂｃｌ ２ 基因的下调机制,以 ５ 氟尿嘧啶（５ Ｆｕ）诱导凋亡,用 Ｐ Ｃ Ｒ 技术扩增出人 ｂｃｌ ２（ｈｂｃｌ ２）基因调控区长度为 ５５８ｂｐ 的片段,经亚克隆后的序列分析证实其准确性．用此 Ｐ Ｃ Ｒ 产物作为探针与 ５ Ｆｕ 刺激 １２ ｈ 后的 Ｍ Ｃ Ｆ ７ 核内蛋白质粗提物进行 Ｓｏｕｔｈｗ ｅｓｔｅｒｎ 印迹及凝胶阻滞（ Ｅ Ｍ Ｓ Ａ）分析．以未用 ５ Ｆｕ 刺激者为对照．结果显示,细胞核内一分子量为 ５３ ｋ Ｄ 的结合蛋白与 ｂｃｌ ２ 调控区的结合信号明显增强,而一种２０ ｋ Ｄ 的 Ｄ Ｎ Ａ 结合蛋白与该区的结合信号明显减弱．这些结果提示ｐ５３ 蛋白有可能是ｂｃｌ ２ 的负转录因子,２０ ｋ Ｄ 的 Ｄ Ｎ Ａ 结合蛋白有可能是ｂｃｌ ２ 的正转录因子．     

神经细胞核蛋白质与淀粉样前体蛋白基因启动子IL-Ⅰ反应元件相互作用研究

研究发现与ＩＬ－１诱导反应相关的ＡＰＰ启动子－４８８／－３０３片段,可与ＳＨ－ＳＹ５Ｙ细胞核抽提物中的核蛋白发生结合作用,并且在ＩＬ－Ⅰ刺激前后有量的变化,ＩＬ－Ⅰ刺激后其结合作用明显加强．冷竞争实验表明,此结合作用具有特异性．同时发现ＡＰＰ启动子－４８８／－３０３片段中的ＡＰ－Ⅰ作用位点及ＳＨ－ＳＹ５Ｙ细胞核抽提物中的ＡＰ－Ⅰ作用因子可能与此结合反应无关,而一个９０ｋＤ蛋白质与此结合反应有关．     

牛生长激素释放因子的融合表达及其产物的化学加工

通过寡核苷酸引导的定位突变,在人工全合成的第２７位为Ｉｌｅ的牛生长激素释放因子［Ｉｌｅ２７］ｂＧＲＦ（１－４４）ＯＨ基因的５＇端ＡＴＧ后插入Ｔｒｐ密码子序列,并分别了构建了Ｐｌ ｐｒｏｍｏｔｅｒ控制下、以β－半乳糖苷酶和ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ结合ＩｇＧ ｄｏｍａｉｎＢ、Ｃ为载体蛋白的融合型基因表达质粒ｐＢＬＥ３１０和ｐＢＬＰＡＥ２Ｄ,在大肠杆菌中得到高效表达。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析,表达产物β－Ｇａｌ     

水稻蜡质基因5＇上游区缺失对基因表达的影响

为研究水稻蜡质基因（ｗａｘｙ）５＇上游调控区中存在的顺式作用元件,我们将水稻ｗａｘｙ基因翻译起始声、（ＡＴＧ）５＇上游３．４ｋｂ（－２１１８～＋１２９１ｂＰ）片段经外切核酸酶ＥｘｏⅢ部分酶解,得到一系列５＇端缺失的片段。将这些缺失片段分别与ｇｕｓ基因编码区连接,构建成融合质粒,经ＰＥＧ介导引入水稻原生质体,２６℃培养４８ｈ后,定量测定ＧＵＳ酶活力,并以同时导入的由３５Ｓ启动子指导的荧光素酶（ＬＵＣ）基因表达的酶活力作为内对照。结果表明,ＧＵＳ酶活性随５’上游调控区长度的减少而逐渐减弱。由─８６１ｂｐ缺失至─６４０ｂＰ时,ｇｕｓ基因表达水平有较明显的降低,推测在该区域中可能存在一个顺式作用元件区。     

美洲拟鲽抗冻肽基因在E.coli中的表达

动物抗冻肽（ＡＦＰ）以降低动物体液冰点而使其能在寒冷的环境中生活,因而ＡＦＰ在防寒抗冻方面有较大的潜力。根据美洲拟鲽ＡＦＰ基因的ｃＤＮＡ序列,人工合成了ＡＦＰ及春含前导序列的ｐｒｏＡＦＰ的ｃＤＮＡ,并构建成ＰＡＦＰ及ＰＰＡＦＰ原核表达载体。由于ＡＦＰ表达量少且蛋白分子很小,用ＳＤＳ－蛋白电泳难以检测。为了提高检测的灵敏度,把报道基因ＣＡＴ的ＣＤＮＡ按读码框连接到ＡＦＰ的３＇末端,构建成融合基因表达     

在酵母体内用RNA聚合酶II表达大肠杆菌tRNA^Sec基因

我们将大肠杆菌的硒代半胱氨酸ｔＲＮＡ基因（ＳｅｌＣ基因）连接到分泌型表达质粒ＰＶＴ１０２Ｕ－αＭＦＬ中,并调整好阅读框架,使蛋白翻译的终止密码子位于ＳｅｌＣ基因的下游。将该质粒转化酵母,通过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析,在ＳＤ液体培养基中检测出７￣８ｋｄ的蛋白条带,这与理论值是相符合的。同时,我们抽提出酵母的总ＲＮＡ用互补与该ｔＲＮＡ ＴψＣ茎环区的２１－ｍｅｒ寡核苷酸,经５＇标记后作为探针进行Ｎｏｒｔｈ     

大鼠精核蛋白的纯化

用大鼠睾丸制备长形精子细胞核及用附睾制备的附睾精子核,用盐酸胍法提取总碱性蛋白。通过ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１００分子筛层析,其第三峰用５％ＴＣＡ沉淀,得到纯大鼠精核蛋白。ＲＰ也可用ＴＢＰ通过ＨＰＬＣ反相柱得到纯化,ＲＰ位于２６％－２８％乙腈梯度。     

优化外源基因在大肠杆菌中表达的翻译起始率的策略 …

ｍＲＮＡ的翻译起始区（ＴＩＲ）的二级结构对翻译起始率有很大的影响。本文建立了一种改进外源基因在大肠杆菌中翻译起始率的系统。以人分裂细胞核抗原（ＰＣＮＡ）基因为模型,将ＰＣＮＡ基因５＇端编码区的１１４ｂｐ的顺序插入质粒ｐＴＺ１９Ｒ中ＬａｃＺ＇的５＇端构成融合基因。用定点突变法在ＰＣＮＡ的ＡＵＧ的－８位插入一个Ｓｈｉｎｅ／Ｄａｌｇａｒｎｏ（ＳＤ）顺序ＧＡＧＧＴ,再以合成的带部分随机序列寡核苷酸作引物,     

诱生型一氧化氮合酶基因启动子的结构及其调控

鼠类ＮＯＳ２基因５′端１．７ｋｂ序列几乎包含了所有的顺式作用元件,其中ＮＦκＢ结合位点,ＩＲＦ－ＲＥ,ＣＡＡＴｂｏｘ和ＧＡＳ４等元件对该在的诱导性转录调控至关重要,人ＮＯＳ２基因５′端３．７ｋｂ范围与鼠类有相似的调控元件,但该区域仅有基础启动子活性,其诱导性调控元件在－３．７ｋｂ的上游,其中ＮＦκＢ结合位点着关键的作用。