优化外源基因在大肠杆菌中表达的翻译起始率的策略和方法(英文)

ｍＲＮＡ的翻译起始区（ＴＩＲ）的二级结构对翻译起始率有很大的影响。本文建立了一种改进外源基因在大肠杆菌中翻译起始率的系统。以人分裂细胞核抗原（ＰＣＮＡ）基因为模型,将ＰＣＮＡ基因５′端编码区的１１４ｂｐ的顺序插入质粒ｐＴＺ１９Ｒ中ＬａｃＺ′的５′端构成融合基因。用定点突变法在ＰＣＮＡ的ＡＵＧ的８位插入一个Ｓｈｉｎｅ／Ｄａｌｇａｒｎｏ（ＳＤ）顺序ＧＡＧＧＴ,再以合成的带部分随机序列寡核苷酸作引物,用ＰＣＲ法在ＳＤ顺序两侧,即ＳＤ上游６个碱基和ＳＤ与ＡＵＧ之间７个碱基,进行随机突变,它们与结构基因５′端序列形成各种可能的翻译起始区（ＴＩＲ）二级结构。重组质粒转化大肠杆菌株ＪＭ１０９（ＤＥ３）,５′ＰＣＮＡ－ｌａｃＺ′ｍＲＮＡ可通过诱导表达Ｔ７ＲＮＡ聚合酶而得到专一而有效的转录。通过在Ｘ－ｇａｌ板上蓝色筛选以及随后的杂交鉴定,共得到２６９个５′ＰＣＮＡ－ｌａｃＺ′融合质粒。从中选择８个不同蓝色的重组子进行β－ｇａｌ活性测定,结果表明它们的酶活性相差在２０倍以上。而ＲＮＡ点杂交表明它们在转录水平无明显的差异。由此提示,通过此策略和方法能得到一个在大肠杆菌中能高效表达的翻译起始区。     

优化外源基因在大肠杆菌中表达的翻译起始率的策略 …

ｍＲＮＡ的翻译起始区（ＴＩＲ）的二级结构对翻译起始率有很大的影响。本文建立了一种改进外源基因在大肠杆菌中翻译起始率的系统。以人分裂细胞核抗原（ＰＣＮＡ）基因为模型,将ＰＣＮＡ基因５＇端编码区的１１４ｂｐ的顺序插入质粒ｐＴＺ１９Ｒ中ＬａｃＺ＇的５＇端构成融合基因。用定点突变法在ＰＣＮＡ的ＡＵＧ的－８位插入一个Ｓｈｉｎｅ／Ｄａｌｇａｒｎｏ（ＳＤ）顺序ＧＡＧＧＴ,再以合成的带部分随机序列寡核苷酸作引物,