relA基因在重组大肠杆菌Bk21合成嘌呤核苷磷酸化酶作用研究

利用Red同源重组技术敲除大肠杆菌BL21中relA基因,获得ArelA突变株。进一步研究表明在LB复合培养中reIA基因对大肠杆菌的生长几乎没有明显影响,但是对其重组蛋白的合成有着较大的影响：降低了25％。结果表明,relA基因在大肠杆菌表达重组蛋白方面有着较重要的作用。     

relA基因敲除对克雷伯氏菌CPK降解毒死蜱的影响

目的:敲除毒死蜱降解菌Klebsiella sp.CPK菌中的relA基凶,研究其对毒死蜱降解的影响.方法:采用同源重组技术敲除了Klebsiella sp.CPK菌中魔斑合成酶编码基因relA,通过PCR及RT-PCR扩增对其敲除进行了验证,分别采用分光光度法和气相色谱检测了该突变体对毒死蜱的耐受性和对毒死蜱的降解.结果:获得了一株relA基因敲除菌株△relA.在毒死蜱胁迫下,△ relA菌株的耐受能力和对毒死蜱的降解能力均弱丁野生型的CPK菌株.在初始降解的第一天,两者的降解速率相差最大,CPK菌株对毒死蜱的降解率高达50%以上,而△relA菌株对毒死蜱的降解率却低于15%.结论:relA基因的产物魔斑参与调控了Klebsiella sp.CPK菌在毒死蜱胁迫下的严谨反应,可能以此增强了该菌株对毒死蜱的耐受性并促进了它对毒死蜱的降解.     

重组马槟榔甜蛋白MabinlinⅡ在大肠杆菌中的表达

Mabinlin Ⅱ是我国所特有且唯一的植物甜蛋白,在体外至今没有得到具有甜味的基因表达产物.本文根据已知马槟榔甜蛋白的序列设计引物克隆Mabinlin Ⅱ基因,对基因进行剪切重组.将重组基因克隆至大肠杆菌表达载体pET-30a(+)中,构建了3个重组表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),得到三株表达重组马槟榔甜蛋白的大肠杆菌工程菌.经IPTG诱导,3个重组MabinlinⅡ基因可在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达.     

假单胞菌M18 relA 突变株的构建及其对吩嗪-1-羧酸合成的调控

假单胞菌M18是一株能同时合成吩嗪-1-羧酸(PCA)和藤黄绿菌素两种抗生素的植物根际分离细菌。RelA催化合成的效应分子ppGpp能介导细菌因营养饥饿引起的应激反应。以M18菌株染色体DNA为模板,PCR扩增获得relA基因,通过庆大霉素抗性片段插入失活与同源重组技术,构建假单胞菌M18的relA突变菌株M18RAG。在PPM培养基中进行PCA发酵分析,发现突变菌株M18RAG的PCA产量显著升高,约为野生型菌株的1.5-2倍。relA基因反式互补实验以及phzA′-′lacZ翻译融合测定结果,均进一步证明了RelA对PCA生物合成及其基因表达具有抑制作用。     

大肠杆菌外源蛋白表达载体稳定性的研究进展

构建高产、稳定、可靠的质粒载体成为基因重组表达技术的研究重点之一。宿主细胞代谢反应和质粒不稳定性相关信息的缺乏,仍然阻碍着质粒载体的优化,成为限制外源蛋白在大肠杆菌中高效表达的瓶颈之一。主要论述了大肠杆菌外源蛋白表达载体的稳定性,分别从质粒和外源基因的本身特性、重组质粒转化对宿主细胞造成的影响及其他因素等方面阐述了对质粒载体稳定性的影响,同时介绍了相关的解决办法,从而为大肠杆菌表达系统高效表达外源蛋白提供参考。     

结核分枝杆菌Rv3369基因的表达和纯化

在大肠杆菌中高效表达结核分枝杆菌Rv3369蛋白,获得纯化的重组蛋白rRv3369。通过聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)扩增Rv3369基因;以质粒pET28a为表达载体,构建重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3);以异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达目的蛋白,通过SDS-PAGE鉴定rRv3369在大肠杆菌中的表达,确定rRv3369在大肠杆菌中的表达形式;采用Ni-NTA His.Bind Resin来纯化重组蛋白。重组质粒pET28a-Rv3369中目的基因测序结果与报道序列相同。分子量约19.5kDa,表达量约占菌体总蛋白的18%,纯化后的重组蛋白样品经SDS-PAGE和激光密度扫描分析表明其纯度为90%以上,每100mL培养菌可获得1.56mg左右的重组蛋白。用亲和层析法纯化的重组蛋白纯度较好。     

CryNGc蛋白在转基因玉米和大肠杆菌中表达的等同性研究

转基因玉米表达蛋白的身份鉴定和对玉米表达蛋白与大肠杆菌表达蛋白的等同性研究是进行蛋白安全性评价的重要前提。以人工合成的新型重组抗虫蛋白CryNGc 为研究材料,通过密码子优化、cryNGc杀虫蛋白编码基因化学合成、原核表达载体构建、大肠杆菌表达条件优化等方法原核表达 CryNGc 蛋白。在此基础上,利用SDS-PAGE电泳、免疫杂交分析和液相色谱-串联质谱鉴定技术对玉米转化体 HiII-NGc-1和大肠杆菌表达的CryNGc重组蛋白进行了特性分析和一致性评价。研究结果表明,抗虫基因cryNGc在转基因玉米和大肠杆菌中表达的蛋白电泳迁移率、免疫活性和氨基酸组成具有一致性,证实玉米转化体HiII-NGc-1中产生的CryNGc蛋白的特性与理论预测相符,且与大肠杆菌表达的CryNGc蛋白实质等同。研究结果为进一步开展新型抗虫重组蛋白CryNGc 玉米转化体的生物安全性评价提供了理论基础和数据支持。     

藤黄微球菌Rpf活性蛋白的制取及其对红球菌VBNC菌体的复苏作用

【目的】克隆藤黄微球菌Micrococcus luteus IAM 14879(=NCIMB 13267)的复苏促进因子Rpf(resuscitation promoting factor)的基因,在大肠杆菌中表达获取基因重组蛋白,考察对近缘高GC革兰氏阳性菌红球菌Rhodococcus sp.DS471活的非可培养VBNC(viable but non-culturable)菌体的复苏促进生长能力。【方法】抽提制备藤黄微球菌的DNA,确定rpf基因引物进行PCR扩增,利用pET15b质粒载体并转化大肠杆菌DE3表达,以SDS-PAGE检验获取纯化重组蛋白;在培养基中添加Rpf,以MPN(most probable number)法计数、评价对VBNC状态菌体的复苏促进生长效果。【结果】基因测序证实获得藤黄微球菌的rpf基因并在大肠杆菌中表达;SDS-PAGE分析表明获得rpf基因的重组蛋白;该蛋白对处于VBNC状态的红球菌具有近100倍的复苏促进生长能力。【结论】成功克隆了藤黄微球菌的rpf基因,在大肠杆菌中获得了表达,表明了Rpf蛋白对处于VBNC状态的红球菌具有复苏促进生长效果。     

枯草芽孢杆菌中性蛋白酶基因的克隆与表达

本研究对枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的基因进行克隆,并在大肠杆菌中诱导表达。从枯草芽孢杆菌基因组克隆到编码中性蛋白酶的全长基因,构建大肠杆菌原核表达载体pET30b,转化大肠杆菌BL21得到重组工程菌。通过菌落PCR和酶切筛选验证重组体。在25℃,110 r/min条件下,用IPTG诱导重组蛋白表达。表达蛋白用SDS-PAGE验证,并对酶活力进行测定。测序结果表明克隆序列与NCBI上的登录的序列同源性高达99%。SDS-PAGE结果表明诱导出的蛋白相对分子质量56.6 kD,酶活力达到39 U/mL。证明成功克隆得到枯草芽孢杆菌中性蛋白酶基因,并在大肠杆菌中得到高效表达。     

肺炎支原体P1粘附蛋白基因的克隆

目的 在大肠杆菌中克隆含肺炎支原体P1粘附蛋白基因的重组质粒,为实现肺炎支原体P1粘附蛋白基因的大量扩增及表达奠定基础。方法 通过PCR方法获取肺炎原体P1粘附蛋白基因,用限制性核酸内酶EcoR Ⅰ切割后与pUC19载体DNA连接,转入大肠杆菌JM109菌株。用X－gal平板筛选转化子,应用P1基因区特异重复序列(RepMP2/3）引物对重组质粒进行PCR扩增和限制性核酸内酶切图谱分析鉴定。结果 PCR和限制性核酸内切酶图谱分析均证实所获重组质粒中含有P1粘附蛋白基因。结论 获得含有肺炎支原体P1粘附蛋白基因的重组克隆。     

抑癌基因Fhit重组腺病毒的构建表达及其在结肠癌细胞中的生物学功能

目的：构建携带抑癌基因Fhit的重组腺病毒并通过其研究Fhit蛋白对结直肠癌细胞增殖能力的影响。方法：利用PCR方法从人胎肝文库中克隆Fhit基因片段,Fhit基因PCR产物连入T载体构建重组质粒pMD18T-Fhit。测序正确后,将基因片段导入ptrack-CMV穿梭质粒中,构建重组穿梭载体ptrack-CMV-Fhit。将经PmeⅠ 单酶切线性化的ptrack-CMV-Fhit和骨架腺病毒质粒pAdEasy-1共转BJ5183大肠杆菌,使ptrack-CMV-Fhit和pAdEasy-1发生同源重组。经PacI酶切鉴定正确后,将重组腺病毒质粒转染293A细胞获得表达Fhit蛋白的重组腺病毒rAd-Fhit,将获得的重组腺病毒感染结肠癌细胞,采用蛋白印迹法检测外源Fhit蛋白的表达,并进一步观察其对细胞增殖能力的影响。结果：我们成功构建了携带有Fhit基因的重组腺病毒,且能够在结肠癌细胞中成功表达Fhit蛋白。在结肠癌细胞中,Fhit蛋白明显减弱了结肠癌细胞的增殖能力。结论：在结肠癌细胞中,Fhit基因可能扮演抑癌基因的角色,而表达Fhit的重组腺病毒很可能成为一种结肠癌生物治疗的新策略。     

家蝇肽聚糖识别蛋白(PGRP-SA)的克隆表达及细菌结合研究

对家蝇PGRP-SA基因进行克隆表达以及研究其重组蛋白与细菌结合能力。从构建的家蝇(Musca domestica)幼虫cDNA质粒文库中筛选到PGRP-SA基因,以cDNA质粒为模板设计引物,通过PCR扩增,获得PGRP-SA基因完整编码序列。运用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白进行预测和分析。构建pET-28a(+)-PGRP-SA重组质粒,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达及蛋白纯化。利用半定量RT-PCR检测PGRP-SA在家蝇3龄幼虫不同组织中的表达量差异。PGRP-SA重组蛋白进行微生物结合实验。结果表明,PGRP-SA基因ORF全长615 bp,编码204个氨基酸,理论分子量22.8 k D,等电点9.11,具有保守的PGRP结构域。成功构建了pET-28a(+)-PGRP-SA重组质粒,蛋白经IPTG诱导后在大肠杆菌中获得表达,经亲和层析柱纯化获得目的蛋白,利用Western blot检测证明纯化蛋白与预期大小相符。PGRP-SA在家蝇3龄幼虫血淋巴、脂肪体、前肠、中肠、气管、马氏管都有表达,血淋巴组织中表达量最高,后肠无表达,由此说明PGRP-SA基因的表达具有一定的组织性。PGRP-SA重组蛋白能与金黄色葡萄球菌和大肠杆菌结合,与白色念珠菌不能结合。成功表达及纯化家蝇PGRP-SA蛋白,证实家蝇PGRP-SA能与金黄色葡萄球菌和大肠杆菌结合。     

立氏立克次体外膜蛋白H基因片段的克隆表达与免疫原性分析

目的：克隆表达立氏立克次体（Rickettsia rickettsii）外膜蛋白H基因（ompH）片段并对其进行免疫原性分析。方法：采用PCR技术从立氏立克次体基因组中扩增ompH基因片段,将该基因片段与原核表达载体pET32a连接,构建重组原核表达质粒pET32a/ompH;将pET32a/ompH转入大肠杆菌细胞内,用IPTG诱导转化大肠杆菌表达目的基因。结果：获得长为327bp的ompH基因片段,SDS-PAGE分析发现pET32a/ompH转化菌表达了大小约27kDa蛋白,该蛋白与立氏立克次体免疫豚鼠血清及斑点热患者血清在免疫印迹分析中呈阳性反应,经该重组蛋白免疫血清中和后的立氏立克次体感染VERO活力减低。结论：pET32a/ompH转化的大肠杆菌表达了ompH基因片段,所产生的重组蛋白具有良好的免疫反应性及保护性。     

牛γ-干扰素在大肠杆菌中的表达及抗原性鉴定

目的在大肠杆菌中高效表达牛γ-干扰素（bovine interferon-γ,BovIFN-γ）,并对其生物活性进行初步鉴定。方法依据GenBank上基因序列人工合成BovIFN-γ基因,PCR方法扩增该基因,将其插入PET-28a载体构建原核表达质粒,转化大肠杆菌BL21中,在IPTG诱导下表达BovIFN-γ,并进行Western blot鉴定。Ni-NTA亲和层析法和电洗脱方法纯化表达的重组蛋白,用Western blot和商品化的BovIFN-γ检测试剂盒进行重组蛋白的抗原性检测。结果成功构建了BovIFN-γ原核表达载体PET-28a-BIFN-γ,并在大肠杆菌中高效表达,表达蛋白约占菌体总蛋白的32%,表达产物主要以可溶性形式存在于菌体裂解液上清中;重组蛋白可与BovIFN-γ单克隆抗体反应,Ni-NTA亲和层析法纯化的重组蛋白抗原活性比电洗脱方法纯化的抗原活性高。结论在大肠杆菌中成功表达了可溶性的BovIFN-γ蛋白,可与BovIFN-γ单抗发生反应,纯化的重组蛋白具有良好的反应原性。     

立氏立克次体外膜蛋白H 基因片段的克隆表达与免疫原性分析

目的:克隆表达立氏立克次体(Rickettsia rickettsii)外膜蛋白H基因(ompH)片段并对其进行免疫原性分析。方法:采用PCR技术从立氏立克次体基因组中扩增ompH基因片段,将该基因片段与原核表达载体pET32a连接,构建重组原核表达质粒pET32a/ompH;将pET32a/ompH转入大肠杆菌细胞内,用IPTG诱导转化大肠杆菌表达目的基因。结果:获得长为327bp的ompH基因片段,SDS-PAGE分析发现pET32a/ompH转化菌表达了大小约27kDa蛋白,该蛋白与立氏立克次体免疫豚鼠血清及斑点热患者血清在免疫印迹分析中呈阳性反应,经该重组蛋白免疫血清中和后的立氏立克次体感染VERO活力减低。结论:pET32a/ompH转化的大肠杆菌表达了ompH基因片段,所产生的重组蛋白具有良好的免疫反应性及保护性。     

小拟南芥chitinase基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

以野生资源小拟南芥(Arabidopsis pumila)chitinase基因的cDNA为基础,采用基因重组技术,将该基因按正确的阋读框架定向克隆于原核表达载体pET-30a( )中,转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达,并对表达产物进行SDS-PAGE分析.结果表明:重组小拟南芥chitinase基因在大肠杆菌中获得高效表达,其分子量约为40 KD.小拟南芥chitinase基因原核表达载体的成功构建和重组小拟南芥chitinase蛋白在大肠杆菌中的高效表达,为进一步研究其生物学功能奠定了基础.     

利用Red重组工程技术解决外源基因在大肠杆菌染色体lac操纵子中的表达

为了应用Red重组工程技术实现外源基因在大肠杆菌染色体上的表达, 寻找染色体上外源蛋白的稳定高效表达位点, 使用Red重组工程系统和kan/sacB无痕迹修饰技术, 将易于定量分析的荧光素酶报告基因替换DY330染色体lac操纵子中的lacZ基因。检测该位点的表达效率结果显示: 大肠杆菌染色体上lac操纵子能够高效稳定表达外源基因, 初步证明了染色体可以作为外源蛋白或抗原的表达载体, 不会影响细菌的生长繁殖。     

利用Red重组工程技术解决外源基因在大肠杆菌染色体lac操纵子中的表达

为了应用Red重组工程技术实现外源基因在大肠杆菌染色体上的表达, 寻找染色体上外源蛋白的稳定高效表达位点, 使用Red重组工程系统和kan/sacB无痕迹修饰技术, 将易于定量分析的荧光素酶报告基因替换DY330染色体lac操纵子中的lacZ基因。检测该位点的表达效率结果显示: 大肠杆菌染色体上lac操纵子能够高效稳定表达外源基因, 初步证明了染色体可以作为外源蛋白或抗原的表达载体, 不会影响细菌的生长繁殖。     

提高大肠杆菌可溶性重组蛋白表达产率的研究进展

大肠杆菌表达重组蛋白相比真核细胞具有成本低廉、大规模发酵容易、条件易于自动化控制等优点,通过大肠杆菌表达重组蛋白是一种高效、经济的途径,重组蛋白表达量可达到大肠杆菌总蛋白质量的50%。具有正常生化活性的重组蛋白通常为可溶性形式,因而对于以得到活性产物(如抗体、酶等)为目的的研究,通常采用可溶性表达途径。目前已有多种以可溶性重组蛋白为活性物质的治疗性药物经批准上市,但并非所有外源基因均能实现可溶性高表达,因此重组蛋白的可溶性高表达具有重要研究价值。在总结近年提高经大肠杆菌可溶性表达重组蛋白产率研究的基础上,从启动子的选择、SD序列的引入、信号肽的优化、宿主细胞的选择、共表达其他蛋白质,高密度发酵等方面阐释在大肠杆菌中提高可溶性重组蛋白表达产率的方法。     

乳糖诱导甜蛋白Monellin在大肠杆菌中的表达

根据已报道的单链Monellin甜蛋白的氨基酸序列,按大肠杆菌基因偏爱密码子,设计和人工合成了单链monellin基因。将单链monellin基因克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a中,构建了重组表达载体pET28a-mon,转化大肠杆菌BL21(DE3),得到表达Monellin的大肠杆菌工程菌株。借助SDS-PAGE分析方法,研究了乳糖代替IPTG诱导大肠杆菌表达甜蛋白Monellin。通过对乳糖作为诱导剂表达条件进行优化,Monellin的表达量可占细胞总蛋白的33.09%,与IPTG诱导表达量接近。本研究结果为乳糖作为诱导剂应用于重组大肠杆菌生产甜蛋白Monellin提供了参考依据。